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Cromatografía de Líquidos de Alta resolución (C.L.A.R.)
Determinación de cafeína en muestras diversas.

1. ¿Qué es la cromatografía de líquidos de alta resolución (C.L.A.R.)?
La cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) es un proceso analítico que utiliza un instrumento especialmente diseñado para separar, cuantificar y analizar los componentes de una mezcla química. La muestrade interés se hace pasar mediante un flujo de disolvente hasta una columna rellena del material especial para llevar a cabo la separación de los componentes, posteriormente dichos componentes pasan a un sistema de detección acoplado con un sistema de grabación de datos. Los componentes básicos del sistema HPLC incluyen: contenedor de disolventes, inyector automático, bomba cuaternaria, columnaanalítica, detector/es y el registrador de datos. Los detectores de los que se dispone son 2: (a) detector ultravioleta-visible de longitud de onda variable y (b) detector LSD (evaporative light-scattering detector). Posee un ordenador donde se incluye el programa Chemstation para controlar tanto los instrumentos como los datos obtenidos.
La cromatografía es una técnica para separar mezclas ensus componentes individuales para que puedan ser identificados y cuantificados. En cromatografía líquida (LC), un líquido en movimiento (fase móvil) lleva la muestra a través de una fase estacionaria (el soporte sólido encontrado dentro de una columna de LC). Los componentes de la muestra se separan en base a sus diferencias de afinidad con la fase estacionaria. La LC es adecuada para elanálisis de moléculas no volátiles y térmicamente sensibles, incluyendo compuestos de alto peso molecular como proteínas. Además, puede ser una herramienta útil para purificar moléculas pequeñas y macromoléculas derivadas de síntesis química o procesos naturales.

2. Señalar las principales características que deben de cumplir tanto las sustancias a separar como la fase móvil a utilizar.La retención hidrofóbica del soluto en la fase estacionaria puede disminuirse añadiendo un
disolvente orgánico a la fase móvil acuosa. Al decrementar la polaridad de la fase móvil, la
distribución de los solutos se cambia hacia la fase móvil. 
La cantidad de muestra que se une a la fase estacionaria depende de la concentración delligando inmovilizado, de las propiedades químicas y físicas de la molécula que va a ser
adsorbida y de la polaridad de la fase móvil y estacionaria. Así, conforme menos polar sea
la fase móvil, menor será la adsorción de la muestra a la fase estacionaria.  
Respecto a las características químicas del ligando, es difícil predecir qué tipo de cadena
hidrocarbonada será mejor para determinada aplicación. En principio, entre menos polar sea la molécula que se va a purificar, se requerirá una fase
estacionaria más hidrofóbica. Sin embargo, si la muestra resulta ser muy afín a la matriz, la
elución se dificultaría.

Hay que tomar en cuenta que la polaridad de la fase móvil A debe ser suficientemente baja como para disolver al soluto de
carácter hidrofóbico y suficientemente alta como para permitir que el soluto se una a la
matriz hidrofóbica.El acetonitrilo y el metanol son los solventes más comunes puesto que ambos tienen baja
viscosidad y no absorben luz UV.   El isopropanol es un disolvente con alto poder de
elución, sin embargo, no es de los más empleados debido a su incrementada viscosidad que
resulta en baja transferencia de masa del soluto entre las fases y elevación de presión aún en
bajos flujos.

3. Mencionar los diferentes tipos decromatografía en C.L.A.R. y sus aplicaciones, incluyendo la cromatografía de fase normal y de fase reversa.
El sistema cromatográfico de fase reversa fue introducido por Howard y Marlin en 1950. Hasta ese momento, la cromatografía de líquidos se utilizaba básicamente para separar compuestos polares, siendo la fase estacionaria de un carácter altamente polar y la fase...