PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN ALCALINA RÁPIDA PARA LA DETECCIÓN DE ADN PLÁSMIDO RECOMBINANTE

 PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN ALCALINA RÁPIDA PARA LA DETECCIÓN DE ADN PLÁSMIDO RECOMBINANTE
H.C.Birnboim and J.Doly
Laboratoire de G6n&tique MoleCculaire, Institut de Recherche en Biologie Moleculaire, F-75221/ Paris Cedex 05, France / Received 3 August 1979
RESUMEN
Se describe un procedimiento para extraer ADN plásmido de células bacterianas. El método es bastante simple permitir elanálisis por electroforesis en geles de 100 o más clones por día aún produce ADN plásmido que es lo suficientemente puro para ser digerible por enzimas de restricción. El principio del método es selectiva desnaturalización alcalina de alto peso molecular de ADN cromosómico mientras restos de ADN circular cerrado covalentemente bicatenario. Control del pH adecuado se logra sin necesidad de utilizar unmedidor de pH. Tras la neutralización, renatures de ADN cromosómico para formar un coágulo insoluble, dejando el ADN plásmido en el sobrenadante. Grande y pequeño plásmido DNAs han sido extraídas por este método.

INTRODUCCION
Plásmido bacteriano DNAs son ampliamente utilizados como vehículos de clonación en la investigación de ADN recombinante. Después se construyen nuevos plásmidos, puedenser aislados y caracterizados con respecto a su tamaño y enzima de restricción el patrón por electroforesis en gel. Un método para la preparación de ADN plásmido en una forma altamente purificada implica suavemente la lisis de las células bacterianas, centrifugación para eliminar la mayor parte de la DNA cromosómica y luego las bandas de ADN residual en un gradiente de cloruro de cesio en presenciade etidio bomide. Covalentemente cerrado ADN circular (CCC) une una cantidad diferente de colorante de abrir circular (OC) o ADN lineal y se separa fácilmente de las últimas dos formas de ADN (1). Un método más rápido, segundo para la preparación de DNA plasmídico emplea cromatografía de hidroxiapatita (2); Esto también produce ADN altamente purificado.

Sin embargo, para muchos propósitosincluyendo análisis por electroforesis en gel, menos el ADN purificado puede ser utilizado. Bajo condiciones favorables, una colonia de células puede ser lisis y ADN plásmido puede ser detectado en extractos crudos después de electroforesis (3-6); Esto permite el análisis de muchos clones y hace posible la proyección. En este informe describimos otro método para la extracción de ADN plasmídico quees simple lo suficiente para permitir la detección de muchas pequeñas muestras, todavía produce ADN plásmido en una forma lo suficientemente pura ser digerible por enzimas de restricción o utilizarse para transformar otras células. En estos aspectos, el procedimiento que describimos es más versátil que otros métodos de extracción rápida. ADN plásmido puede detectarse en tan poco tiempo como 0,1 mlde cultivo líquido no amplificados o en una colonia de células de raspado de una placa.




PRINCIPIO DEL MÉTODO DE EXTRACCIÓN ALCALINA

Los trabajadores anteriores han demostrado que existe un estrecho rango de pH (sobre 12.0-12.5) dentro de que la desnaturalización del ADN lineal pero no CCC-DNA ocurre y que esta propiedad puede utilizarse para purificar el CCC-ADN (7-10,20,21). Hemosutilizado este enfoque para el desarrollo de un método de extracción rápida de plásmido DNAs. Las células que contienen plásmidos son tratadas con lisozima para debilitar la pared celular y lisis entonces completamente con dodecil sulfato de sodio (SDS) y NaOH. Eligiendo cuidadosamente la relación de la suspensión celular con solución de NaOH, se obtuvo un valor de pH alcalino reproducibles sinla necesidad de controlar el pH con un metro; más control del pH se obtiene mediante la inclusión de glucosa como un tampón de pH. ADN cromosómico, aún en forma muy alto peso molecular, es selectivamente desnaturalizado ind cuando el lisado es neutralizado por acetato de sodio ácido, la masa de renatures de ADN cromosómico y agregados para formar una red insoluble.

Simultáneamente, la alta...