PROCEDIMIENTO DE PLASMIDO

PROCEDIMIENTO
FUNCIÓN
Extracto crudo de células se le adiciona la sol. I, resuspender con el vortex e incubar en hielo
Debido al pH=8 que posee hace que el DNA se encuentre cargado negativamente,EDTA secuestra iones calcio que son utilizados como cofactor por las enzimas que se encargan de la degradación del DNA, la glucosa evita la lisis celular por un cambio en la presión osmótica
Agregar lasol. II y mezclar invirtiendo el tubo 3 a 4 veces e incubar en hielo 5 minutos
SDS de la solución dos rompe membrana bacteriana, para que todo quede disuelto en el medio además de desnaturalizar lasproteínas, el NaOH lleva acabo una hidrolisis alcalina del DNA genómico mientras que el DNA plásmidico solo se desaparea pero permanecen unidas ambas cadenas.
Adicionar la sol. III, mezclar e incubaren hielo 5 minutos
Es para llevar a cabo el proceso de salting out el cual nos ayuda a quitar las proteínas, DNA genómico y algunos lípidos, pero no es capaz de precipitar el DNA plásmidico debido aque este es muy pequeño por lo cual se quedara suspendido en la solución y volverán a aparearse las dos cadenas de este DNA.
Centrifugar 5 min. A 13000rpm y recuperar el sobrenadante agregar la sol.IV, mezclar e incubar en hielo 5 minutos
Ayuda a la precipitación del DNA plásmidico debido a que disminuye la constante dieléctrica del mismo.
Centrifugar 5 min. A 13000 rpm desechar el sobrenadante ydejar secar, agregar la solución V, resuspender con la micropipeta
Es para mantener un pH constante y que nuestro DNA tenga una carga negativa en estas condiciones, el EDTA actúa como agente quelanteevitando la hidrolisis del plásmido ya que quita los iones divalentes que actúa como cofactor para las hidrolasas del DNA.
Tomar de 5-10 microlitros de DNA plásmidico y adicionar de 5-6 microlitrosde azul de bromofenol
Este colorante esta en glicerol, debido a que este es más denso que el agua hace que nuestra muestra de DNA plásmidico se vaya al fondo y además al poseer un color nos permite...