Procedimiento

Biología Celular y Molecular. Guía de TP Nro. 3 Ensayos de proliferación, adhesión y migración celular in vitro.
Introducción La valoración de la proliferación celular y la citotoxicidad in vitro es, muchas veces, la primera aproximación que el investigador tiene cuando se propone testear los efectos de una droga sobre un tipo celular. Los ensayos desarrollados para medir estos parámetros vandesde la utilización de agentes radioactivos, 3 como la incorporación de H , a la medición de metabolitos celulares o la utilización de colorantes cuya concentración se correlaciona con el número celular. Muchas veces estos primeros datos dan una buena idea al investigador sobre qué tipo de respuesta podría esperar de la droga al utilizarla in vivo. La adhesión y la migración son comportamientoscelulares que pueden ser medidos in vitro utilizando ensayos relativamente simples. La adhesión celular es el proceso por el cual la célula se ancla a un sustrato. Para ello utiliza varios tipos de proteínas y otros componentes de membrana, como las integrinas y los glucolípidos. En la migración interviene primordialmente los filamentos de actina para poder generar prolongaciones celulares,filopodios, lemelipodios y pseudópodos, encargadas de ser el flanco de avance celular. Así, gracias a la utilización de estas prolongaciones la célula puede desplazarse sobre el sustrato. Estos dos últimos comportamientos se ven bien representados en los macrófagos. Estas células dependen fuertemente de los procesos de adhesión y de migración para su correcto accionar dentro del organismo. Un macrófagoestimulado tiene la capacidad de adherirse al endotelio y extravasarse, atravesando la membrana basal, migrando entonces hacia la zona extravascular.

Desarrollo de la práctica En este trabajo práctico, el alumno se familiarizará con técnicas para valorar la proliferación, la migración y la adhesión de células cultivadas in vitro en respuesta al suero fetal bovino (SFB), un estimulador usadogeneralmente en el cultivo de líneas celulares. Repique y recuento celular Cada grupo recibirá una placa de 60 mm de diámetro confluente de células F3II derivada de un carcinoma mamario murino como materia prima para la práctica. Utilizando los conocimientos adquiridos en el TP Nro. 2 el alumno deberá repicar, contar las células del frasco y preparar una suspensión celular para utilizarla en losensayos posteriores de proliferación y adhesión. Proliferación celular El ensayo de proliferación celular se realizará para evaluar la capacidad mitogénica que induce el suero fetal bovino (SFB) sobre células eucariontes. Protocolo - 1era parte 1) Preparar 18 ml de medio de cultivo MEM, 1% Gln, con una concentración celular 50.000 cel / ml. 2) Dividir el medio en 6 tubos con 3 ml c/u 3) Rotular lostubos con la concentración de suero correspondiente 4) Agregar a los tubos el suero para conseguir la concentraciones de suero 0, 2, 4, 6, 8 y 10%. 5) Sembrar una placa de 24 wells con 0,5 ml / well, según:
Control 0% SFB Control 0% SFB 2% SFB 4% SFB 6% SFB 8% SFB 10% SFB 2% SFB 4% SFB 6% SFB 8% SFB 10% SFB

Grupo 1 Grupo 2

Control 0% SFB Control 0% SFB 2% SFB 4% SFB 6% SFB 8% SFB 10% SFB 2% SFB4% SFB 6% SFB 8% SFB 10% SFB

2da.parte

6) Se deja incubar 48 hs. en estufa a 37°C con una atmósfera de 0,5% CO2. 7) Pasado el tiempo de incubación, fijar las células con 0,5 ml de formalina al 10% durante 15 min. 8) Descartar la formalina y agregar 0,5 ml de toluidina 0,5% dejando actuar por 15 min. 9) Descartar la Toluidina y relizar dos lavados con 0,5 ml de PBS para retirar el coloranteinespecífico. 10) Solubilizar las células en 2 ml de SDS 1%. 11) Leer la absorbancia en un espectrofotómetro a 595 nm. Ensayo de adhesión Con las células restantes se realizará un ensayo de adhesión celular sobre plástico a distintas concentraciones de SFB. Protocolo 1) Preparar 5 ml de MEM, 1% Gln, con una concentración celular de 250.000 cel/ml 2) Dividir esta suspención en tres tubos de...