PROCESAMIENTO DE CEPAS PARA REALIZAR EL ANTIBIOGRAMA

Departamento Microbiología
CONTENIDO
• Método de Kirby-Bauer.

INTRODUCCIÓN
Varios métodos de laboratorio pueden ser usados para determinar ¨in vitro¨ la susceptibilidad de bacterias ante agentes antimicrobianos. En muchos laboratorios de microbiología clínica, la prueba de difusión en agar es usada en forma rutinaria para bacterias de rápido crecimiento y algunas bacterias fastidiosaspatógenas.
El método que actualmente recomienda el Sub Comité de Ensayos de Susceptibilidad del Laboratorio Internacional de Referencia (Nacional Committee for Clinical Laboratory Standars o NCCLS), está basado por el método originalmente descrito por Bauer et al., (Método de Kirby-Bauer). Este es el método de difusión en disco en que se han desarrollado estándares para su interpretación y estáapoyado por datos clínicos y de laboratorio.
EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS
Equipos
• Incubadora a 350C
• Estereoscopio
• Refrigerador doméstico

Materiales
• Aplicadores de algodón
• Lápiz cristalográfico
• Asas de nicrón
• Pinzas y agujas de inoculación
• Placas de Petri
• Tubos de 13 x 100 con tapa de rosca estériles
• Tubos de 13 x 100 sin tapa de rosca estériles
2• Alcohol 90 %
• Regla graduada en mm
• Cepas ATCC de control

Reactivos
• Medio de Agar Müeller Hinton
• Caldo Müeller Hinton
• Discos de antibiótico

Estándar de turbidez para preparación del inóculo
Para estandarizar la densidad del inóculo para una prueba de susceptibilidad, se utiliza estándar de turbidez de BaSO4 equivalente a un estándar 0.5 McFarland o su equivalenteóptico. El cual esta compuesto por una solución de 0,5 mL de la solución BaCL2 x 2H2O al 1,175 % (p/v) en 99,5 mL de una solución de ácido sulfúrico 1 %. El mismo se puede conservar durante 6 meses a la temperatura ambiente, en la oscuridad y herméticamente cerrado.
Objetivos
• Conocer la sensibilidad in vitro de un determinado germen aislado a un grupo de discos de antibióticos.

Alcance• Se le realizará a todas las cepas que se les desee conocer su patrón de susceptibilidad antibiótica, las cuales serán todos los gérmenes aislados como patógenos de muestras clínicas.

Responsabilidades
• Técnico que trabaja las muestras y profesional que atiende el trabajo de ese cubículo.

Condiciones de bioseguridad
• Ver manual de bioseguridad del laboratorio.

Operacionespreliminares
• Los gérmenes que se van a trabajar en esta sección deben ser previamente identificados como Gram positivos o Gram negativos y se enviarán a dicha sección en cultivo puro, libre de contaminaciones, y con una rotulación según el número de entrada y el tipo de muestra.
• Los medios de cultivo en este caso son el Agar Müeller Hinton y el caldo Müeller Hinton, los cuales se prepararan enla sección de Medios de cultivo. El Agar Müeller Hinton debe ser preparado como mínimo con un día de antelación para un mejor secado de las placas.

Procedimiento 3
Preparación del inóculo
• Método de crecimiento
􀂕Al menos 3 a 5 colonias bien aisladas y del mismo tipo de morfología se seleccionan de un agar de cultivo. Se toca la colonia por arriba con un asa y el crecimiento setransfiere a un tubo con 4 a 5 mL de un medio de cultivo adecuado, tal como caldo Müeller-Hinton.
􀂕El caldo de cultivo es incubado a 36ºC hasta que alcance la turbidez del estándar de 0.5 McFarland (usualmente 2 a 6 horas). Esto resulta en una suspensión que contiene aproximadamente 1 a 2 x 10 8 UCF/mL.
􀂕La turbidez del caldo se ajusta con solución salina estéril o con caldo para obtener unaturbidez ópticamente comparable a un estándar de 0,5 McFarland.

Inoculación de las placas
• En un lapso de tiempo óptimo de 15 minutos después de ajustar la turbidez de la suspensión del inóculo, un aplicador de algodón se sumerge en ella. El aplicador debe ser rotado varias veces y presionado firmemente contra la pared interna del tubo sobre el nivel de líquido. Esto remueve el exceso de...