Producción de metabolitos de interés a partir de inóculos microbianos.

1. INTRODUCCIÓN

El crecimiento de un microorganismo se define como un incremento progresivo de células cuando se les proporciona un sustrato adecuado rico en nutrientes, vitaminas y minerales.
Durante este proceso, muchos microorganismos son capaces de usar estos nutrientes para llevar a cabo sus procesos celulares y muchos de sus funciones eliminando productos de desecho al medio.

Parala obtención de metabolitos de interés, es necesario el uso de bioprocesos para tal fin.
En un proceso fermentativo, los sustratos que componen el medio de cultivo son transformados por acción microbiana. El microorganismo de interés va aumentando su biomasa en el transcurso del proceso y al mismo tiempo el sustrato se va consumiendo con formación de productos como consecuencia de lasactividades catabólicas y anabólicas. Los dos fenómenos tienen lugar durante el desarrollo del proceso simultáneamente.

Para que se lleve a cabo el proceso fermentativo es necesario conocer las variables involucradas en el proceso como tiempos, temperatura, disponibilidad de oxígeno, pH, fase de crecimiento de los microorganismos y disponibilidad de nutrientes entre otras. Con el control de estosparámetros, se garantiza que los procesos que ocurren en el interior del fermentador sean los apropiados y óptimos para el desarrollo del microorganismo y la producción de los metabolitos de interés.

2. OBJETIVOS
Evaluar la producción del metabolito de interés con los microorganismos seleccionados, usando como fuente de carbono azúcares fermentables.
Manejar las variables de un procesofermentativo como pH, contenido de azúcares fermentables, temperatura y tiempo.
Cuantificar por medio de la técnica de espectrofotometría la biomasa en función del tiempo.
Determinar el consumo de sustrato en función del tiempo utilizando la técnica de azúcares reductores 3,5 Dinitrosalicílico.
Cuantificar por medio de técnicas directas como recuento en cámara de Neubauer y recuento en placa lacantidad de microorganismos obtenidos en el inóculo en función del tiempo.


3. METODOLOGÍA

3.1 Elaboración del mosto a utilizar
De acuerdo a la materia prima que el grupo proyecto está trabajando, pesar los siguientes reactivos y agregarlos al sustrato.


REACTIVO
CANTIDAD g/L
Azúcares fermentables
200
Extracto de levadura
3
KH2PO4
1
MgSO4 7H2O
0,5
Peptona
5
(NH4)2 SO4
0,5Ajustar el pH a 5,5 con una solución de NAOH al 0,1N

3.2 Montaje de la fermentación discontinua
Lleve a autoclavar el mosto a 7 lb de presión por 7 minutos después de haberlo filtrado y clarificado.
Deje enfriar el mosto hasta 30 °C
Tome una alícuota de 50 ml1, centrifúguelos a 4600 rpm por un periodo de 15 minutos. Tome el sobrenadante, descartando el precipitado y realice la medición deazúcares reductores con lo que comenzará su fermentación. Para esto utilice la técnica de DNS explicada en el numeral 6.3
Para la realización del inóculo, tome el 10% del total del medio de cultivo y ajuste su turbidez al patrón número 2 de MacFarland. La concentración de este patrón 6x108 UFC/ml.
Tome 0,5 ml del inóculo puro y dilúyalo con 4,5 ml de solución salina estéril.
Agregue unagota de azul de metileno a cada uno de los tubos.
Colocar con la ayuda de un capilar tome 10 µL de la dilución y realice el montaje en la cámara de Neubauer.
Enfoque primero a 4X la cámara y luego pásela a 40X con el cuidado de no partir la laminilla ni la cámara.
Revise que las células se encuentren en proceso de gemación y que se encuentren viables.
Realice una coloración de Gram
Una vezconfirmado la viabilidad de las levaduras, adicione el inóculo a la fermentación, homogenice y tome una muestra de 5 mL en condiciones estériles. Esta muestra la utilizará más adelante para determinar la curva de crecimiento microbiano, el recuento por espectrofotometría y el recuento en placa.
Tapa bien el frasco de su fermentación y llévelo al agitador por un periodo de 7-12 días a 20 ◦C y...