produccion de amilasa fungicas

PRODUCCION DE AMILASAS FUNGICAS OBJETIVO El trabajo prctico consiste en el aislamiento de hongos productores de enzimas hidrolticas del almidn, produccin de estas enzimas, medicin de su actividad enzimtica en forma soluble e inmovilizada y su utilizacin para la produccin de etanol. INTRODUCCION Las enzimas que hidrolizan el almidn son un conjunto de enzimas ((-amilasa, (-amilasa,glucoamilasa y enzimas desramificadoras) hidrolticas que catalizan la degradacin del almidn. Cada enzima tiene una actividad caracterstica generando distintos productos como se observa en la siguiente figura. Existen amilasas de uso industrial tanto de origen bacteriano como fngico.  Las amilasas son producidas a gran escala para su uso en la industria de la alimentacin y de la produccin de combustibles.Los usos ms importantes son 1. Hidrlisis parcial del almidn para generar dextrinas que son utilizadas como espesantes. 2. Obtencin de jarabe de alta maltosa (Glu-Glu) utilizados en la fabricacin de la cerveza y confituras (dulces, helados, tortas). 3. Obtencin de jarabes de alta glucosa utilizados en la fabricacin de cerveza, panes y repostera, confituras y bebidas no alcohlicas. 4. Remocin delalmidn utilizado como apresto en la industria textil. 5. Hidrlisis parcial del almidn en la industria panadera para la liberacin de glucosa que es sustrato de fermentacin de las levaduras para producir el leudamiento de la masa. 6. Hidrlisis del almidn para ser utilizado como fuente de carbono en diversas fermentaciones, entre ellas la produccin de etanol para uso alimenticio y combustible. DISEOEXPERIMENTAL Parte I AISLAMIENTO Y SCREENING Da 1 Aislamiento (1 parte) Se colocan semillas de lenteja sobre un medio Slido de agar YPD conteniendo 5 NaCl (para evitar el desarrollo de especies Mucorales) y 0.01 tetraciclina (antibitico que inhibe el crecimiento bacteriano). Se colocan 4 semillas por caja de Petri. Se incuba a 28C durante 7 das. Da 2 Aislamiento (2 parte) Las colonias de hongos(preferentemente las verdes sobre las negras o blancas) se repican con un escarbadiente en cajas de Petri con agar YPD. Se incuba a 28C durante 7 das. Da 3 Screening de cepas productoras de amilasas (1 parte) Las colonias aisladas se pican en cajas de Petri con medio slido de almidn 1 y agar 1.5 . Se incuba a 28C durante 4 das. Da 4 Screening de cepas productoras de amilasas (2 parte) Las cepasproductoras de enzimas hidrolticas del almidn se detectan observando el halo de degradacin del almidn (crculo claro alrededor de la colonia). Para facilitar la deteccin, se revela la presencia de almidn en el medio por el agregado de solucin de I2/KI (0.026 I2 0.26 KI) que se acompleja con el polisacrido dando una coloracin azul. Parte II PRODUCCION DE AMILASAS Da 4 Produccin de esporas Lascolonias con actividad amilsica se repican en tubos en pico de flauta conteniendo medio de 5 salvado triturado y agar 2 . Se estra con ansa cada colonia en un pico de flauta. Se incuba a 28C durante 5 das. Da 5 Produccin de enzimas por fermentacin en sustrato slido Las esporas de cada pico de flauta se resuspenden en 5 ml de solucin acuosa de Sarkosyl 0.05 . Se inocula 1 ml de la suspensin deesporas en erlenmeyers de 250 ml conteniendo 5 g de salvado y 5 ml de agua destilada. Se incuba a 28C durante 5 das. Da 6 Extraccin de las enzimas La enzimas extracelulares producidas en la fermentacin del salvado por el hongo se extraen con 50 ml de NaCl 1.0 . Agitar durante 30 min a temperatura ambiente. Filtrar por papel de filtro y conservar el eluido. Parte III MEDICION DE LA ACTIVIDADENZIMATICA Da 6 Medicin de la actividad enzimtica La actividad amilsica se determinar utilizando almidn como sustrato. Se cuantificar la desaparicin del sustrato por espectrofotometra. La solucin de sustrato consiste en una solucin de almidn tamponada (0.05 almidn, 0.15 M NaCl, 0,1 M acetato de sodio pH 5.0). La reaccin enzimtica se detiene por el agregado de un revelador (0.006 I2 0.06 KI en HCl...