Profo

DETERMINACION DE PROTEINAS (Método de Lowry)

1) Tomar 20 (l de muestra o estándar (agua en el caso del blanco)
2) Agregar 2 ml de reactivo "C". Agitar y reposar 10 min.
3) Agregar 200 (l de reactivo "D". Agitar y reposar 40 min.
4) Leer absorbancia a 700 nm

Proteínas
REACTIVOS
1) Reactivo "A": Na2CO3 al 2% en NaOH 0.1 N (5 gr. de Na2CO3 en 250 ml de NaOH 0.1N)
2) Reactivo "B": CuSO4al 0.5% en Citrato de Sodio 1% (0.05 gr. de CuSO4 en 10 ml de Citrato de Sodio)
3) Reactivo "C": 1 ml de reactivo "B" en 50 ml de reactivo "A"
4) Reactivo "D": 1 ml de Folin + 1.3 de agua destilada


▪ NaOH 0.1 N: 0.4 gr. de NaOH en 100 ml agua destilada
▪ Citrato de Sodio 1%: 1 gr. de citrato en 100 ml agua destilada


CURVA DE CALIBRACION:

1) Preparar Stock de albúmina(25 mg en 8 ml de agua destilada)

|Estándar ((g/20(l) |Tomar del stock((l) |Tomar de agua ((l) |
|12.5 |200 |800 |
|25.0|400 |600 |
|37.5 |600 |400 |
|50.0 |800|200 |
|62.5 |1000 |_____ |



Las proteínas se leen en el espectrofotómetro en el programa de Lowry.









PREPARACIÓN DEL GEL


Gel separador 12% Gelconcentrador 5%
| |10 ml |5 ml |5 ml |3 ml |
|H2O destilada |3.3 ml |1.65 ml |3.4 ml |2.04 ml |
|Tris-HCl 1.5M, pH 8.8 |2.5 ml|1.25 ml |--------- |----------- |
|Tris-HCl 0.5M, pH 6.8 |---------- |---------- |630 (l |400 (l |
|Acrilamida-Bis 30% |4.0 ml |2.0 ml |830 (l |500(l |
|SDS 10% |100 (l |50 (l | 50 (l | 50 (l |
|PSA 10% |100 (l |50 (l | 50 (l | 30 (l |
|ADICIONAR AL MOMENTO DE VACIAR A LA CÁMARA|
|TEMED |4 (l |2 (l |5 (l |3 (l |





Buffer de muestra 2X para el gel
(Tris-HCl 0.125M, SDS 4%, Glicerol 20%, Mercaptoetanol 10%, pH 6.8)Tris............................................ 2.5 ml de la sol´n (3)
SDS........................................... 4 ml de la sol´n (4)
Glicerol.................................... 2 ml
Mercaptoetanol......................... 1 ml
Azul de bromofenol.................. 0.01 gr.
Agua ...................................... Aforar a 10 ml (el azul de bromofenol debe disolverse primero en el...