Prote nas de Fusi n C1
Páginas: 6 (1415 palabras)
Publicado: 24 de agosto de 2015
Genética Molecular 2011
Expresión y purificación
de Proteínas de Fusión
¿Qué es una proteína de fusión?
Es a combinación de una proteína de interés fusionada a otra proteína o péptido
conocidos, denominados Tags. Los Tags pueden estar en el NH2 o COOH.
Tag
Mi Proteína
Mi Proteína
Tag
¿Qué herramienta biológica de la síntesis de proteínas se
utiliza para crear una proteína de fusión?Básicamente, un mRNA con un marco abierto de lectura (open reading frame,
ORF) de codones cualquiera, sin STOPs, puede ser traducido a proteína. Las
proteínas de fusión se basan en esta premisa.
Codón de inicio: ATG (Met)
Codones STOP: TAG, TGA TAA
¿Por qué son importantes las proteínas de fusión?
Las técnicas de ADN recombinante revolucionaron la producción y purificación de
proteínas. Permite lapurificación de la proteína en pocos pasos, y evita purificar
proteínas endógenas.
ADN recombinante
Clonado de gen de interés
en
marco con la secuencia del
Tag
bacterias
(o cel. eucariota)
Fusión de secuencia del gen
de interés con secuencia del Tag
mucha proteína
Introducción del ADN
recombinante en
bacterias o línea celular donde
se expresa la proteína de fusión
¿Qué sistema elegirían paraexpresar proteínas recombinantes
y tener mucha proteína?
Lo más común es usar Escherichia coli
Ventajas:
Se obtiene mucha cantidad de proteína, es fácil de crecer, de inducir y de
purificar la proteína de fusión.
Desventajas:
No realizan modificaciones post-traduccionales, necesarias para el correcto
plegamiento y/o actividad de ciertas proteínas. Es posible que no haya un
correcto plegamiento dela proteína y haya que pasar a otro sistema (células
de mamífero, de insecto, levaduras…).
¿Cuando se debe inducir la expresión de una proteína en
bacterias?
Fase exponencial (o Log): máxima tasa de división celular; maquinaria transcripcional
y traduccional muy activa.
Vectores inducibles de expresión en procariotas:
se basan en el sistema del operon lac (requerido para el
transporte ymetabolismo de la lactosa en E. coli)
En la práctica:
situaciones de
represión y
activación de la
transcripción del
gen de interés
Sistema pET: doble sistema de inducción;
disminuye la expresión “leaky”
Cuerpos de inclusión: problema o ventaja?
Son agregados insolubles de proteína desnaturalizada.
Su formación depende de la naturaleza de la proteína y su nivel de expresión.
Son fácilmentepurificables (casi todo proteína recombinante), pero para obtener la
proteína hay que hacerlo en condiciones desnaturalizantes (urea 8M).
Cuerpos de inclusión
de β-lactamasa en E.
coli.
Las fusiones permiten:
• Fácil y rápida purificación de la proteína expresada en bacterias,
basada en las propiedades del Tag (cromatografía de afinidad, anticuerpos).
M: marker
L: lisado de bacterias
F: percolado
E:eluído
Las fusiones permiten:
• Direccionar la localización de proteínas de fusión en bacterias:
Periplasma: fácil purificación, pocas proteínas contaminantes, ambiente
favorable para el buen plegamiento y la formación de puentes disulfuro.
Secreción al medio: pocas proteínas contaminantes, fácil purificación.
• Aumentar la solubilidad de las proteínas de fusión.
• Caracterización de proteínas(principalmente en interacciones proteína:proteína;
ensayo de doble hibrido, GST-pull down, co-inmunoprecipitación).
• Localización de proteínas en células eucariotas por fusión a proteínas o Tags
fluorescentes (microscopía de fluorescencia) o Tags contra los que hay
anticuerpos comerciales (inmunofluorescencia).
Clasificación de Tags (muchos Tags cumplen más de una función)
Por afinidad a unligando (GST)
De purificación
De purificación
GST (Glutathione S-Transferase):
26 kDa, originalmente clonada del parásito Schistosoma japonicum. Muy fácil
purificación. GST aumenta la solubilidad de la proteína.
CO H
2
H N
2
O
H
N
OH
N
H
O
O
H
La proteína de fusión
se purifica por
cromatografía de
afinidad usando
glutation inmobilizado
sobre agarosa.
Ventajas:
Elución suave
Buen...
Expresión y purificación
de Proteínas de Fusión
¿Qué es una proteína de fusión?
Es a combinación de una proteína de interés fusionada a otra proteína o péptido
conocidos, denominados Tags. Los Tags pueden estar en el NH2 o COOH.
Tag
Mi Proteína
Mi Proteína
Tag
¿Qué herramienta biológica de la síntesis de proteínas se
utiliza para crear una proteína de fusión?Básicamente, un mRNA con un marco abierto de lectura (open reading frame,
ORF) de codones cualquiera, sin STOPs, puede ser traducido a proteína. Las
proteínas de fusión se basan en esta premisa.
Codón de inicio: ATG (Met)
Codones STOP: TAG, TGA TAA
¿Por qué son importantes las proteínas de fusión?
Las técnicas de ADN recombinante revolucionaron la producción y purificación de
proteínas. Permite lapurificación de la proteína en pocos pasos, y evita purificar
proteínas endógenas.
ADN recombinante
Clonado de gen de interés
en
marco con la secuencia del
Tag
bacterias
(o cel. eucariota)
Fusión de secuencia del gen
de interés con secuencia del Tag
mucha proteína
Introducción del ADN
recombinante en
bacterias o línea celular donde
se expresa la proteína de fusión
¿Qué sistema elegirían paraexpresar proteínas recombinantes
y tener mucha proteína?
Lo más común es usar Escherichia coli
Ventajas:
Se obtiene mucha cantidad de proteína, es fácil de crecer, de inducir y de
purificar la proteína de fusión.
Desventajas:
No realizan modificaciones post-traduccionales, necesarias para el correcto
plegamiento y/o actividad de ciertas proteínas. Es posible que no haya un
correcto plegamiento dela proteína y haya que pasar a otro sistema (células
de mamífero, de insecto, levaduras…).
¿Cuando se debe inducir la expresión de una proteína en
bacterias?
Fase exponencial (o Log): máxima tasa de división celular; maquinaria transcripcional
y traduccional muy activa.
Vectores inducibles de expresión en procariotas:
se basan en el sistema del operon lac (requerido para el
transporte ymetabolismo de la lactosa en E. coli)
En la práctica:
situaciones de
represión y
activación de la
transcripción del
gen de interés
Sistema pET: doble sistema de inducción;
disminuye la expresión “leaky”
Cuerpos de inclusión: problema o ventaja?
Son agregados insolubles de proteína desnaturalizada.
Su formación depende de la naturaleza de la proteína y su nivel de expresión.
Son fácilmentepurificables (casi todo proteína recombinante), pero para obtener la
proteína hay que hacerlo en condiciones desnaturalizantes (urea 8M).
Cuerpos de inclusión
de β-lactamasa en E.
coli.
Las fusiones permiten:
• Fácil y rápida purificación de la proteína expresada en bacterias,
basada en las propiedades del Tag (cromatografía de afinidad, anticuerpos).
M: marker
L: lisado de bacterias
F: percolado
E:eluído
Las fusiones permiten:
• Direccionar la localización de proteínas de fusión en bacterias:
Periplasma: fácil purificación, pocas proteínas contaminantes, ambiente
favorable para el buen plegamiento y la formación de puentes disulfuro.
Secreción al medio: pocas proteínas contaminantes, fácil purificación.
• Aumentar la solubilidad de las proteínas de fusión.
• Caracterización de proteínas(principalmente en interacciones proteína:proteína;
ensayo de doble hibrido, GST-pull down, co-inmunoprecipitación).
• Localización de proteínas en células eucariotas por fusión a proteínas o Tags
fluorescentes (microscopía de fluorescencia) o Tags contra los que hay
anticuerpos comerciales (inmunofluorescencia).
Clasificación de Tags (muchos Tags cumplen más de una función)
Por afinidad a unligando (GST)
De purificación
De purificación
GST (Glutathione S-Transferase):
26 kDa, originalmente clonada del parásito Schistosoma japonicum. Muy fácil
purificación. GST aumenta la solubilidad de la proteína.
CO H
2
H N
2
O
H
N
OH
N
H
O
O
H
La proteína de fusión
se purifica por
cromatografía de
afinidad usando
glutation inmobilizado
sobre agarosa.
Ventajas:
Elución suave
Buen...
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