proteinas de fusion
• 2 problemas principales con la
expresión de proteínas foráneas
– Degradación
– Purificación
Proteínas de fusión
• Degradación
– produce un nivel bajo de expresión
– esdificil la purificación de la proteína
deseada
• Una solución para la degradación
– Unir la proteína target a una proteína
celular estable (tag o carrier)
Proteínas de fusión
• Proteína de fusión (anivel DNA o genes)
– Región que codifica una proteína celular
fusionada en marco de lectura a la región que
codifica para la proteína target
– Cuando se transcribe y traduce genera una
proteína defusión
Proteínas de fusión
Carrier o tag
• en el extremo -NH2 o –COOH de la proteína
- un dominio con actividad catalítica
- un dominio antigénico
- una señal peptídica topogénica
• protege deproteólisis a la proteína de interés
• mejora la solubilidad de la proteína
• estabiliza a la proteína de interés
Proteínas de fusión
stable gene
gene of interest
MET ... LEU ARG THR MET VAL ILE ... EndATG ... GTG CGA ACC ATG GTG ATC ... TAG
Nco I
Note: translation stop of cellular gene must be removed
Note: reading frame of fusion protein must be contiguous
Proteínas de fusión
• Clivado porproteasas
– Clivan una corta y definida secuencia de
aa
– La secuencia de clivado para la proteasa
entre el gen carrier y el gen de interés
protease cleavage sequence
fusion partner
gene of interestSitio de clivado para el Factor Xa
Purificación de proteínas de
fusión
• La proteína de fusión se une a una
molécula pequeña o anticuerpo (Ab)
• La molécula pequeña o Ab pueden
estar unidos a unamatriz inerte
• La proteína de fusión se unirá, las otras
no
• La proteína purificada se eluirá de la
columna
Purificación por cromatografía de afinidad
3
1
2
4
Proteínas de fusión
• A veces lasobreexpresión puede
reducir la cantidad de proteína
recuperada
– La proteína forma agregados insolubles:
Cuerpos de inclusión
– La formación de agregados puede deberse
a un plegamiento incorrecto...
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