proteinas (leche) Biuret
Páginas: 10 (2384 palabras)
Publicado: 17 de noviembre de 2014
PRÀCTICA 2 :QUANTIFICACIÓ DE PROTEÏNES PEL MÈTODE BRADFORD (grups de 4 alumnes)
Data inici: Data final:
Objectiu
En aquesta pràctica es pretén determinar el contingut de proteïnes dels aliments comuns o de qualsevol altra font de material d'origen biològic.
Fonament
L’assaig de la proteïna de Bradford és un mètode ràpid, senzill i barat per determinar el contingut deproteïnes d'una mostra. L'assaig és basa en d’unió del colorant, Blau de Coomassie “Coomassie Brilliant Blue” G-250 (CBB), a les proteïnes donant coloració. Els resultats es poden llegir directament amb un espectrofotòmetre.
El colorant Blau de Coomassie G-250 existeix en múltiples formes. En el seu estat catiònic té un color marró-vermellós, amb un màxim d’absorció de 470 nm nm. Quan el colorants'uneix i interactua amb els aminoàcids, es converteix en una forma estable desprotonada de color blau, i el pic màxim d'absorció canvia de 470 nm a 595 nm. L’unió és un procés ràpid (uns dos minuts) i el complex colorant-proteïna es manté estable fins i tot una hora desprès de produir-se. Aquesta forma estable blava del colorant és fàcil d'observar i quantificar amb un espectrofotòmetre. Hi ha unacorrelació amb la quantitat de color blau i la quantitat de proteïna en la mostra. Com més proteïna, més intens serà el color blau. Mitjançant l'ús de patrons de proteïna de concentració coneguda, es pot generar una corba estàndard espectrofotomètricament. A continuació, es pot utilitzar la corba per determinar la quantitat de proteïnes en una mostra desconeguda, basada en la intensitat del blau.L'anàlisi de Bradford és simple, altament sensible i relativament poc afectada per molts reactius de laboratori i productes químics comuns. Com que en aquesta reacció el Colorant blau de Coomassie s’uneix específicament a les proteïnes, és un bon mètode per a la seva caracterització. A més, aquesta reacció té una major sensibilitat si la comparem amb la reacció del Biuret. Això vol dir que devegades pot obtenir-se una reacció positiva amb el reactiu de Bradford, però negativa amb el Biuret.
La interacció química d'unió del colorant de Coomassie G-250 es mostra a la figura 1:
El colorant s'uneix a les proteïnes utilitzant tres tipus d'interaccions.
La primera interacció del colorant amb les proteïnes es produeix a través de l'arginina, un aminoàcid molt bàsic, que interactua ambels grups sulfat carregats negativament a través d'interaccions electrostàtiques.
Hi ha altres interaccions més febles proteïna-colorant com la interacció dels anells aromàtics de Coomassie G-250 amb els anells aromàtics dels aminoàcids, com el triptòfan, a través d'electrons deslocalitzats. Finalment, el colorant també pot interactuar dèbilment amb els aminoàcids polars que tenen R-grupshidròfobs, com l'anell aromàtic de la tirosina.
L’unió de la proteïna al colorant el converteix en una forma estable, no protonada, de color blau.
Per a la construcció de la recta de calibratge s’utilitzen dilucions d’una proteïna pura (proteïna patró) que en el nostre cas es albúmina bovina. Un cop preparat el banc de dilucions, es realitza la reacció de Bradford amb cadascun d’ells.Posteriorment es llegeix l’absorbància dels diferents patrons amb un espectrofotòmetre a una longitud d’ona de 595 nm i es representa el gràfic Absorbància versus concentració de proteïnes. El interval de linealitat d’aquest mètode es troba entre 0,1 i 1 mg/ml. La corba obtinguda s’assembla a la de la figura 2:
En aquesta pràctica determinarem el contingut de proteïnes de la llet. La concentració deproteïna en la llet de vaca es de uns 30-40 g/L. El percentatge varia amb la raça de la vaca.
Material i reactius
Albúmina bovina BSA (Sigma Chem, Saint Louis MO. USA) ó MerK tenim 20 g nevera Q-2.Hem comprat Albumin Fraktion V (casa ROTH Art-Nr. 8076.2 , 50 g www.carlroth.com). Totes dues funcionen bé.
Reactiu de Bradford 5x (color marró) preparat mínim 24 h abans:
Blau de Coomassie...
Data inici: Data final:
Objectiu
En aquesta pràctica es pretén determinar el contingut de proteïnes dels aliments comuns o de qualsevol altra font de material d'origen biològic.
Fonament
L’assaig de la proteïna de Bradford és un mètode ràpid, senzill i barat per determinar el contingut deproteïnes d'una mostra. L'assaig és basa en d’unió del colorant, Blau de Coomassie “Coomassie Brilliant Blue” G-250 (CBB), a les proteïnes donant coloració. Els resultats es poden llegir directament amb un espectrofotòmetre.
El colorant Blau de Coomassie G-250 existeix en múltiples formes. En el seu estat catiònic té un color marró-vermellós, amb un màxim d’absorció de 470 nm nm. Quan el colorants'uneix i interactua amb els aminoàcids, es converteix en una forma estable desprotonada de color blau, i el pic màxim d'absorció canvia de 470 nm a 595 nm. L’unió és un procés ràpid (uns dos minuts) i el complex colorant-proteïna es manté estable fins i tot una hora desprès de produir-se. Aquesta forma estable blava del colorant és fàcil d'observar i quantificar amb un espectrofotòmetre. Hi ha unacorrelació amb la quantitat de color blau i la quantitat de proteïna en la mostra. Com més proteïna, més intens serà el color blau. Mitjançant l'ús de patrons de proteïna de concentració coneguda, es pot generar una corba estàndard espectrofotomètricament. A continuació, es pot utilitzar la corba per determinar la quantitat de proteïnes en una mostra desconeguda, basada en la intensitat del blau.L'anàlisi de Bradford és simple, altament sensible i relativament poc afectada per molts reactius de laboratori i productes químics comuns. Com que en aquesta reacció el Colorant blau de Coomassie s’uneix específicament a les proteïnes, és un bon mètode per a la seva caracterització. A més, aquesta reacció té una major sensibilitat si la comparem amb la reacció del Biuret. Això vol dir que devegades pot obtenir-se una reacció positiva amb el reactiu de Bradford, però negativa amb el Biuret.
La interacció química d'unió del colorant de Coomassie G-250 es mostra a la figura 1:
El colorant s'uneix a les proteïnes utilitzant tres tipus d'interaccions.
La primera interacció del colorant amb les proteïnes es produeix a través de l'arginina, un aminoàcid molt bàsic, que interactua ambels grups sulfat carregats negativament a través d'interaccions electrostàtiques.
Hi ha altres interaccions més febles proteïna-colorant com la interacció dels anells aromàtics de Coomassie G-250 amb els anells aromàtics dels aminoàcids, com el triptòfan, a través d'electrons deslocalitzats. Finalment, el colorant també pot interactuar dèbilment amb els aminoàcids polars que tenen R-grupshidròfobs, com l'anell aromàtic de la tirosina.
L’unió de la proteïna al colorant el converteix en una forma estable, no protonada, de color blau.
Per a la construcció de la recta de calibratge s’utilitzen dilucions d’una proteïna pura (proteïna patró) que en el nostre cas es albúmina bovina. Un cop preparat el banc de dilucions, es realitza la reacció de Bradford amb cadascun d’ells.Posteriorment es llegeix l’absorbància dels diferents patrons amb un espectrofotòmetre a una longitud d’ona de 595 nm i es representa el gràfic Absorbància versus concentració de proteïnes. El interval de linealitat d’aquest mètode es troba entre 0,1 i 1 mg/ml. La corba obtinguda s’assembla a la de la figura 2:
En aquesta pràctica determinarem el contingut de proteïnes de la llet. La concentració deproteïna en la llet de vaca es de uns 30-40 g/L. El percentatge varia amb la raça de la vaca.
Material i reactius
Albúmina bovina BSA (Sigma Chem, Saint Louis MO. USA) ó MerK tenim 20 g nevera Q-2.Hem comprat Albumin Fraktion V (casa ROTH Art-Nr. 8076.2 , 50 g www.carlroth.com). Totes dues funcionen bé.
Reactiu de Bradford 5x (color marró) preparat mínim 24 h abans:
Blau de Coomassie...
Leer documento completo
Regístrate para leer el documento completo.