proteinas

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO
TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS III
PRÁCTICA N° 4: MÉTODO COLORIMÉTRICO PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES Y ALBÚMINA.
I. INTRODUCCIÓN
Las proteínas son compuestos orgánicos macromoleculares, ampliamente distribuidos en la naturaleza y esenciales para la vida. Actúan como elementos estructurales y de transporte y aparecen bajo la forma de enzimas,hormonas, anticuerpos, factores de coagulación, etc.
Una manera de evaluar la eficiencia de los métodos de extracción de proteínas es determinando el contenido de proteína solubles que se obtienen después de la etapa de extracción.
II. OBJETIVOS.
-Determinar el contenido de proteínas totales.
-Determinar el contenido de albúmina.
III. MARCO TEÓRICO.
FUNDAMENTO DEL MÉTODO:
Determinación deProteínas totales: Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico, en medio alcalino, para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540 nm, cuya intensidad es proporcional a la concentración de proteínas totales en la muestra.

Determinación de Albúmina: La albúmina reacciona específicamente – sin separación previa- con la forma aniónica de la 3,3’,5,5‘- tetrabromocresolsulfon ftaleína (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio tamponado a pH 3,8. El aumento de absorbancia a 625 nm respecto del blanco de reactivo, es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra.

IV. MATERIALES Y MÉTODOS.

REACTIVOS PROVISTOS:
-Reactivos EDTA/Cu: Complejo EDTA /Cu 13 mmol/l en NaOH 875 mmol/l y alquil aril poliéster (AAP).
-Reactivo BCF:solución de 3,3’,5,5‘- tetrabromo cresolsulfon ftaleína (en polioxietilén lauril éter)
-Suero patrón: Solución de albúmina y globulinas en estado nativo con título conocido de proteínas (Biuret o Kjeldhal) y albúmina.
MATERIAL REQUERIDO
-Espectrofotómetro o fotocolorímetro.
-Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados.
-Tubos de Fotocolorimetro o cubetas espectrofotométricas.-Baño de agua a 37°C
-Reloj o timer.
Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: Si la muestra no procesa inmediatamente la muestra puede conservarse hasta 3 días en refrigerador (2 -10°C) o una semana en congelador.

1.- DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES.
CONDICIONES DE REACCIÓN
-longitud de onda: 540 nm de espectrofotómetro o fotocolorímetro con filtro verde (520 -560 nm).-Temperatura de reacción: 37°C
-Tiempo de reacción: 15 minutos.
-Volumen de muestra: 50 ul
-Volumen de reactivo EDTA/Cu: 3.5 ml
-Volumen final de reacción:3.55 ml
PROCEDIMIENTO
En tres tubos de fotocolorímetro marcados B(Blanco), S (Standard) y D (Desconocido), colocar:
B S D
Agua destilada 50 ul - -
Suero patrón - 50 ul -
Muestra - - 50 ul
Reactivo EDTA/Cu 3.5 ml 3.5 ml 3.5 ml

Mezclar convarilla. Incubar 15 minutos a 37°C. Leer en espectrofotómetro a 540 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (520-560 nm) llevando a cero con el blanco de reactivo.

Estabilidad de la mezcla de reacción final.
El color de la reacción es estable durante 12 horas por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso.

DETERMINACIÓN DE ALBUMINA:
Condiciones de reacción:
-Longitud de onda:625 nm en espectrofotómetro o en fotocolorímetro con filtro rojo (620-650 nm).
-Temperatura de reacción: 15-28°C.
-Tiempo de reacción: 10 min.
-Volumen de muestra: 10 ul.
-Volumen de reactivo BCF: 3,5 ml.
-Volumen final de reacción: 3,51 ml.

PROCEDIMIENTO
En tres tubos de fotocolorímetro marcados B(Blanco), S (Standard) y D (Desconocido), colocar:
B S D
Suero patrón - 10 ul -Muestra - - 10 ul
Reactivo BCF 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml

Mezclar con una varilla. Mantener los tubos entre 15 y 28 °C durante 10 minutos. Leer en espectrofotómetro a 625 nm o en fotocolorímetro con filtro rojo (620-650 nm) llevando a cero con el blanco de reactivo.
Estabilidad de la mezcla de reacción final.
El color es estable 20 minutos por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese...