Proteínas

Ejemplo de un Trabajo práctico para la determinación cuantitativa de proteínas(1)
Objetivos.
Al término de la práctica el alumno ha de ser capaz de: 1. Conocer los principales métodos de valoración de las proteínas. 2. Recordar las leyes básicas de absorción de luz para la determinación cuantitativa de compuestos coloreados. 3. Definir los componentes de un comprender el manejo del mismo.espectrofotómetro que permita

4. Construir una recta de calibración con una solución de albúmina de suero bovino como proteína patrón para cada una de los métodos colorimétricos del Biuret y de Lowry. 5. Establecer el desarrollo de los métodos determinando la linealidad, la sensibilidad, el límite de detección y el rango de cada uno de los métodos ensayados.

1. ¿Cuáles son los métodos más usualesde valoración de las proteínas?
Existen diversos métodos que permiten cuantificar la concentración de proteína presente en las muestras biológicas, basados en las propiedades que muestran las proteínas en solución. Los métodos más usuales son: - Reacción del Biuret. - Método de Lowry. - Método de Bradford. - Método del ácido Bicincónico. - Absorción en el ultravioleta. - Métodos inmunológicos.1

Este apunte fue tomado como ejemplo de la Universidad de Madrid, Facultad de Química página web: (http://www.um.es/bbmbi/).

En la práctica se van a ensayar los dos primeros métodos colorimétricos de Biuret y Lowry.

¿En qué consiste la reacción del Biuret?

El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la condensación de dos moléculas de urea con eliminaciónde amoníaco.

H 2N H 2N

CO CO Urea

NH 2 NH 2

Q

H 2N

CO

NH CO NH 2

Biuret

Reacción del Biuret Si una solución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO4) se añade a una solución de proteína se forma una complejo entre el ion cúprico y los enlaces peptídicos, con aparición de una coloración violeta-púrpura, que presenta un máximo de absorción a 540 nm. Lascaracterísticas más importantes de la reacción son: · La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los péptidos y proteínas. · Su rango de determinación es de 1 a 6 mg/ml. · No depende de la composición de aminoácidos. · Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reacción.
O C NH RC H O C NH RC H Cu2+ HN H CR C HN H CR O C O

Violeta-púrpura Complejo proteína-Cu(II)

¿Cuál esel fundamento del método de Lowry?

Para aumentar la sensibilidad de la reacción del biuret, el complejo proteínaCu2+ se hace reaccionar con el reactivo de Folin-Ciocalteus, dando una coloración azul, con un máximo de absorción a 650 nm. Esta coloración se atribuye a la reducción del ácido fosfomolíbdico/fosfotúngstico a azul de heteropolimolibdeno de composición no definida, por medio de losresiduos tirosilos, triptofanilos, y en menor grado, cisteinilos e histidilos de las proteínas que forman el complejo con el Cu2+. Las características del método son: · La intensidad de la coloración varía con la composición de aminoácidos de la proteína. · Es más sensible que el ensayo del biuret. El rango es de 0,1-1 mg/ml. · La modificación de Hartree incrementa la sensibilidad de 0,015-0,15mg/ml. · Presenta muchas interferencias.

Complejo Proteína-Cu 2+ AA red.

Complejo Proteína-Cu 2+ AA oxid.

Reactivo Folin oxid. AMARILLO

Reactivo Folin red. AZUL

Esquema de la reacción de Lowry

¿Qué características poseen otros métodos de valoración de proteínas?

Método de Bradford: · Consiste en la formación de un compuesto de adsorción de coloración azul entre los residuos deaminoácidos básicos de las proteínas y el colorante Azul Coomassie. · Absorbe luz a 595 nm. · El rango de determinación de proteína es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5 -1,4 mg/ml (ensayo estándar).

· La intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos básicos y aromáticos.

Método del ácido Bicincónico. · Está basado en la reducción en medio alcalino de Cu(II) a Cu(I) en...