Protocol Pràctiques Proteòmica

Biotecnologia – Universitat de Vic

Pràctiques de Proteòmica

Pràctiques de Proteòmica. Curs 2013/2014

Resum




Materials


Reactius/fungibles



Equipament

Procediment


Pas 1: Preparació de mostra



Pas 2: Quantificació de proteïnes pel mètode de BCA (Bicinchoninic
Acid - based Protein Assays)
(Dia 1)



Pas 3: Digestió tríptica de la mostra



Pas 4: Preparació de la mostra per aanàlisi d’espectrometria de masses
MALDI-TOF-MS i/o LC-MS
(Dia 3)

(Dia 1)

(Dia 2)

1

Biotecnologia – Universitat de Vic

Pràctiques de Proteòmica

MATERIALS
Reactius i fungible


Micro BCA™ Protein Assay Kit



Sèrum Albúmina Bovina



Ditiotreitol (DTT)



Iodoacetamida (IAA)



Tripsina



Bicarbonat amònic (NH4HCO3) (ABC)



Matriu àcid α-ciano-4-hidroxicinàmic



Acetonitril (ACN)

Àcid fòrmic (FA)



Àcid trifluoroacètic (TFA)



Puntes pipeta (10 µL, 100 µL i 1 mL)



Eppendorfs (1.5 mL)



Falcons 15 i 50 mL



Cubetes de plàstic per espectrofotòmetre



Guants sense pols

Equipament


Agitador (vòrtex)



Agitador de superfície per gels



Platina calefactora/ estufa (fins 60ºC)



Micropipetes automàtiques (2-20-200-1000 µl)



Microcentrífuga eppendorf

pH meter/ tires per mesurar pH



Espectrofotòmetre (lectura 570 nm)

Crític. Utilitzar guants per tal d’evitar contaminacions amb queratines,
que interfereixen amb l’anàlisi posterior d’espectrometria de masses i
finalment amb l’ identificació de proteïnes.
Crític. Utilitzar aigua ultra pura, milli-Q. La font i puresa dels reactius és
crítica.

2

Biotecnologia – Universitat de Vic

Pràctiquesde Proteòmica

PROCEDIMENT
DIA 1
1. Preparació de mostra
Resuspendre la mostra en 1mL tampó bicarbonat amònic 50mM (ABC 50 mM)
2. Quantificació de proteïnes per mètode de Àcid Bicincrònic (BCA)
Per a realitzar la valoració s’haurà de preparar una patró o estàndard de BSA (sèrum
albúmina bovina) en la que es referiran el valors de les mostres a valorar. En els cas
que es conegui el rang deconcentracions de la mostra, les concentracions de la patró
seran aquelles que restin en aquest rang. Si pel contrari es desconeix el rang, els punts
de la recta patró seran aquells que aproximin millor el coeficient de determinació de
la recta patró mitjançant la regressió lineal.
a) Preparació de la recta patró:
Preparar la recta patró d’albúmina amb l’albúmina subministrada pel kit tal com
s’indica enla següent taula (en aquest moment s’ha ajustar la temperatura del
bloc/estufa a 60ºC):

Via
l

Volum de
diluent (uL)

Volum solució
de BSA (uL)

A

9800

200

B

1100

1100

C
D
E
F

1100
1100
1100
1100

1100
1100
1100
0

dilució

Volum restant per utilitzar
en la patró de BSA (uL)

Concentració final de BSA
(µg/mL)

stock

1/50

8900

40

A

1/2

1100

20

B

1/2

1100

10

C

1/2

1100

5

D1/2

1100

2,5

E

0

1100

0

b)

Preparació del reactiu de quantificació:
Sabent que per cada reacció de valoració es necessiten 1000 µL, preparar el volum
necessari amb els tres reactius del kit (A, B, C) amb les següents proporcions: 25/50
parts (500 µL) de A, 24/50 parts (480 µL) de B i 1/50 parts (20 µL) de C. Fer un
vòrtex per homogeneïtzar.
c) Preparació de la mostra/ patró:
Diluir lamostra fins a 1000 µL H2O MQ en un eppendorf de 1.5 mL, agitar i
transferir 1000 µL a un falcon de 15 mL. Per la patró: addicionar 1000 µL de cada
dilució (solució A fins a F) en falcon de 15 mL.

3

Pràctiques de Proteòmica

Biotecnologia – Universitat de Vic

d) Inici de la reacció de quantificació:
Addicionar tant a la mostra com a les solucions diluïdes de la patró 1000 µL de la
barreja dereacció, fer un vòrtex i incubar durant 50 min a 60ºC.
e) Agitar les mostres, transferir-les a la cubeta i fer la lectura de l’absorbància a
570nm.
f) Traçar la recta patró amb els valors d’absorbància obtinguts de les diferents
concentracions de BSA.
g) Calcular la concentració de la mostra problema.

4

Biotecnologia – Universitat de Vic

Pràctiques de Proteòmica

DIA 2

3. Digestió de proteïnes...