Protocolo cDNA

Informe Bioq271
Módulo Proteína recombinante

“Preparación de cDNA a partir de riñón de cerdo, clonamiento y trasformación de producto en bacterias JM109”



1. Objetivo

A partir detejido de riñón de cerdo y mediante la extracción de RNA total, generar cDNA para el clonamiento en vector TOPO y transformar el producto en bacterias competentes JM109, realizando la purificación del DNAplasmidial y confirmando el clonamiento mediante un ensayo de restricción.

2. Material y métodos


Muestra de
Riñón de cerdo
(27 grs)3. Resultados




Figura 1. Electroforesis en gel. Fraccionamiento electroforético en gel de agrarosa 1%, (St) estándar de tamaño molecular GeneRuler DNA ladder1kb (1) Producto de clonamiento de fragmento de PCR en vector TOPO TA (2) restricción enzimática con NDEI y BamHI de plasmidio aislado de bacterias JM109 transformadas (3) producto de PCR del genFBPasa de cerdo. El gel se corrió por 40 min a 100V.




Tabla 1 Determinación de grado de pureza de DNA plasmidial.

A260
A280
Grado de pureza(A260/ A280)
Concentración (µg/ml)
0,010
0,0071,429
250
Determinación de pureza de DNA plasmidial extraído de cultivo bacteriano E. coli JM109 de acuerdo a la razón de las absorbancias a 260 y 280nm (A260/ A280), se determinó la concentraciónde DNA considerando el factor de dilución utilizado para la determinación (200) y el factor OD para DNA de 50μg/mL.






Fig. 2. Grafico curva de calibración de determinación de tamañomolecular. Se grafica la migración relativa Rf, de las bandas correspondientes al estándar de tamaño molecular GeneRuler DNA ladder 1kb, respecto al frente de corrida en cm versus el Log del tamaño molecularen pares de bases de las bandas. Se presenta la línea de tendencia cuya función es Log PM = -2,194 Rf + 4,103; r2= 0,990.

Tabla 2. Datos correspondientes a la curva de calibración
Tabulación de...