Protocolo De Extracción De Rna De Levadura

EXTRACCIÓN DE RNA de Saccharomyces (modif. SCSIE)
Mantener todo en hielo, usar guantes y material preparado especialmente para RNA (40‘ autoclave). En todos los pasos de fenolización emplear tuboscon tapón de rosca de 2 ml.

1.- Inocular precultivos de las cepas toda la noche.
2.- Inocular 25 mL de medio fresco con estos precultivos a DO600= 0,18 y crecer hasta DO600 ( 0,6.
3.- Centrifugara 4ºC / 5 minutos / 3500rpm en falcon de 50 mL.
4.- Lavar con H2O de RNA. (unos 10mL)
5.- Congelar el pellet a -80ºC toda la noche (opcional).
6.- Se descongelan las muestras en hielo.
7.-Preparar tubos con tapón de rosca de 2 mL con perlas de vidrio (500 μl).
8.- Resuspender las células en 500 (L de LETS y 500 (L de fenol-tris para RNA.
9.- Romper las células en el Fast-Prep o MiniBeadbeater, 6 x 30 segundos, con periodos intercalados de 30 segundos en hielo.
10.- Centrifugar a 4ºC durante 5 minutos a 13000rpm.
11.- Recoger el sobrenadante en nuevo tubo y extraer de nuevo confenol-tris de RNA. Vórtex.
12.- Centrifugar a 4ºC durante 5 minutos a 13000rpm.
13.- Recoger el sobrenadante y extraer con fenol-cloroformo (5:1) de RNA.
14.- Centrifugar a 4ºC durante 5 min a 13000rpm.15.- Repetir la extracción con fenol-cloroformo (5:1) dos veces más.
16.- Recoger el sobrenadante y extraer con cloroformo-alcohol isoamílico (24:1). Vórtex.
17.- Centrifugar a 4ºC durante 5 min a13000rpm.
18.- Recoger el sobrenadante y precipitar con 1 V de LiCl 5M, a –20ºC durante toda la noche.
19.- Centrifugar a 4ºC durante 20 minutos a 13000rpm.
20.- Lavar con EtOH al 70% (unos500(L).
21.- Dejar secar el pellet (en este punto yo no lo seco, recojo los restos de SN con una P20 después de dar un pulso de centrífuga).
22.- Resuspender en 500 (L de H2O de RNA.
23.- Precipitar con1/10 V de NaOAc 3M y 2 V de EtOH absoluto, a –80ºC durante 2-3 horas.
24.- Centrifugar a 4ºC durante 20 minutos a 13000rpm.
25.- Lavar con EtOH al 70%.
26.- Quitar los restos de SN con P20 y...