Protocolo De Tincion De Células Con Ioduro De Propidio

Protocolo tinción de células con Ioduro de propidio para determinación de integridad celular. Aplicado al análisis del efecto de toxinas killer

Materiales e insumos:
* Eppendorf de 1,5ml.* Placa con células sensibles.
* Concentrado de Toxina killer.
* Buffer PBS:
* 2g/l KH2PO4
* 6,1g/l Na2HPO4
* 80g/l NaCl
* Ajustado a pH 7,6
* Ioduro depropidio (50ug/ml) preparado en buffer PBS.
* Portaobjetos y cubreobjetos.
* Guantes de látex.

Equipos:
* Micropipetas automáticas
* Microcentrífuga
* Flujo laminar
* Microscopiode fluorescencia.

Procedimiento:
A) Preparación de suspensión de células:
* Repicar en placa de medio GPY la cepa sensible con 24hs. de antelación.
* Realizar una suspensión deaproximadamente 1.107 cél/ml de la cepa sensible.

B) Incubación con la toxina killer:
* Incubar con la toxina el tiempo necesario y en la proporción necesaria.
* Los controles negativos serealizan con las células incubadas con agua, buffer o también con la toxina hervida durante 10min.
* Se puede utilizar como control positivo las células incubadas con alcohol 70% durante 2h.
*Tomar 200ul de la mezcla.
* Es conveniente tomar una muestra a t=0
* Centrifugar 2 min a 5000rpm y verificar la aparición de un pellet de células.
* Retirar el sobrenadante con cuidado.C) Lavados:
* Resuspender las células en 1ml. de buffer PBS.
* Centrifugar durante 2 min. a 5000 rpm.
* Descartar el sobrenadante.
* Resuspender las células en 1ml. de buffer PBS.* Centrifugar durante 2 min. a 5000 rpm.
* Retirar el sobrenadante.

D) Tinción con ioduro de Propidio.
* Agregar 25ul de buffer PBS + Ioduro de Propidio (50ug/ml).
* Incubar30min. En oscuridad.

E) Observación en el microscopio.

* Tomar 5ul y leer en el microscopio de fluorescencia utilizando guantes.
* Es conveniente realizar una observación en modo campo...