Protocolo De Una Inmunocitoquímica

INMUNOCITOQUÍMICA: sintasa del óxido nítrico y GABA en cerebro de ratón.


INTRODUCCIÓN
La inmunocitoquímica es una técnica que sirve para la localización de moléculas mediante reacciones antígeno-anticuerpo, lo que le confiere una gran afinidad y especificidad.
Los elementos usados en este método son los siguientes:
 El antígeno es la molécula que va a ser reconocida por elanticuerpo. Los antígenos tienen dos características básicas, la antigenicidad y la inmunogenicidad. La primera es la característica propia que les permite ser reconocidos por los anticuerpos, una proteína pequeña o muy plegada tendrá mucha menos antigenicidad que una desplegada o más grande, ya que tendrá más regiones antigénicas para poder ser reconocidas. La inmunogeniciedad es la capacidad de generaruna respuesta inmune por el organismo, para que esto suceda dos factores son importantes; el tamaño, cuanto más grande mayor superficie de acoplamiento de anticuerpos (antigenicidad), y la similaridad con las moléculas del organismo en sí, ya que el sistema inmune, no genera una respuesta a las moléculas propias, sino se daría lugar a una patología.
 Los anticuerpos (inmunoglobulinas, Ig)están formados por dos pares de cadenas unas ligeras y las otras pesadas, contienen una región constante, la fracción cristalizable (Fc), y una región variable, la cual reconoce el antígeno. Son producidos por linfocitos B, habitualmente se usa el Ig-G, al ser monomérico y el de mayor concentración en el organismo. En nuestro caso, se usaran dos anticuerpos (técnica indirecta); uno primario, quereconoce al antígeno y uno secundario que reconocerá la Fc del primario y tendrá acoplado la batería necesaria para producir señal con enzimas o sustancias fluorescentes. Debido a la inmunogenicidad, los anticuerpos para el análisis son de especies con cierta distancia filogenética, el secundario para reconocer la Fc de la Ig-G primaria deberá ser diferente a los otros dos animales, esta técnica sueleser la más usada porque es más barata y mucho mas cómoda, ya que careces de la necesidad de generar un complejo Anticuerpo-enzima o fluorocromo, por cada antígeno. Solo debes generar una inmunoglobulina contra molécula antigénica y este ya será reconocido por el secundario, que producirá la señal.
Existen anticuerpos policlonales y monoclonales, caracterizándose porque los primeros no sonreproducibles una vez acabado el suero y reconocen varios epítopos, y los segundos se generan por líneas celulares inmortales que reconoces a un único epítopos. El proceso de producción se resume en el siguiente esquema:

 La señal es necesaria para poder reconocer la agregación de los complejos Ig-Ag, hay de dos tipos; la de fluorescencia y la enzimática, a mayor capacidad de producir señal conmenos antígeno mayor sensibilidad, en nuestro caso vamos a usar una señal enzimática conocida por el método de la avidina-biotina peroxidasa. Las ventajas de esta técnica, es que a diferencia del de fluorescencia puede durar años y luego transportarse al microscopio electrónico, sin embargo la fluorescencia pierde su actividad con bastante rapidez, su ventaja es que pueden representarse variosantígenos (por anticuerpos) en una misma célula, ya que es discriminativa por diferentes fluorescencias (roja, verde…), que esta cualidad será a la vez la desventaja de nuestro método al usar peroxidasa, ya que el color siempre será el mismo pudiéndose distinguir únicamente un antígeno por muestra. La avidina-biotina forma agregados intensificando la señal, aun habiendo baja concentración de antígeno.Vamos a estudiar la localización de dos proteínas; la NOS, enzima que produce el nuero transmisor gaseoso, oxido nítrico y el GABA principal neurotransmisor inhibidor. Encontrándose, por tanto, ambas en el sistema nervioso, nosotros concretamente observaremos en el sistema nervioso central.

MATERIAL Y MÉTODOS

Previamente a nuestra práctica hay que realizar los pasos de anestesia,...