Protocolo Esferoides Metilcelulosa

PROTOCOLO PARA ENSAYO DE ESFEROIDES

Material necesario
Solución de metilcelulosa 1% ( Sigma-Aldrich #M-7077 (100g))
FBS
Placas multipocillo de baja adherencia (Costar#3473-24 well)

Dia 1
Preparación de la solución de metilcelulosa al 1%

Pesar 3g de metilcelulosa en una botella de vidrio con una mosca para agitar dentro. Mandar a autoclavar.
Día2

Una vez autoclavado, dentro de la campana de cultivos, añadir 250 ml del medio de cultivo correspondiente ( Con FBS o SIN FBS, según interés) [la solución debe ser al 1% pero sepesa un poco más de metilcelulosa porque el polvo se pierde un poco por las paredes]. Agitar hasta que se disuelva por completo.

Alicuotar la solución dentro de la campana decultivos en falcons de 50 ml y centrifugar a 2000xG durante 15 minutos. Este paso es para sedimentar los cristales de metilcelulosa que no han quedado disueltos, porque interfierenluego a la hora de mirar las muestras al microscopio. Recoger el sobrenadante en un tubo nuevo.

Preparación de las células

Lavar con PBS las células y tripsinar. Preparar unasolución a 100.000 cél/ml en el medio de cultivo de las células.
En metilcelulosa al 1% añadir 10ul de la solución de células preparada previamente-Cf 1000c/ml
Sembrar 1 ml por pocillo= 1000 células (cada condición por triplicado como mínimo)
Hidratar las células cada 2 o 3 días con unas gotas de medio (con FBS o sin FBS según corresponda)

Día 15
Cuantificarlos esferoides al cabo de 14 días aproximádamente (aunque puede variar según cada línea celular). Hacer fotos con el microscopio. Para cuantificar los esferoides se aprecian bien almicroscopio sin necesidad de fijar ni teñir. Si se desea se pueden fijar con una solución de paraformaldehido al 4% durante 20 minutos y posteriormente teñir con MTT o Cristal Violeta.