Protocolo Hanahan MIO

Protocolo Hanahan
Preparación de las células ara la transformación.

1. Usar un asa de inoculación y extraer colonias directamente del stock congelado y sembrar en una placa con medio SOB agar. Incubar la placa durante 16 horas 23°C.
2. Tomar 4 a 5 colonias bien aisladas en tubos con 2mL de medio SOB (las colonias no deber pasar los 2-3 mm)
3. Incubar por 16 horas a 23°C conagitación.
4. Transcurridas las 16 horas, añadir a cada tubo glicerol estéril con concentración final de 15% v/v
5. Poner 1mL de la solución anterior en tubos de 2,5mL, póngalos en una bolsa plástica con cierre, y sumerja la bolsa durante 5 minutos en un baños frio.
6. Poner la bolsa y su contenido a -80°C.
Preparación de células competes
7. En 250ml de medio SOB inocular 1mL de stock viable (paso6)
8. Incubar el cultivo a 20°C en una incubadora con agitación durante 16 horas. De vez en cuando comprobar la densidad óptica de una alícuota a 600nmn, permitiendo que no crezca más de OD600 > 0,26.
9. Transferir el cultivo previamente enfriado a botellas de centrifuga, y centrifugar por 10 minutos a 4°C.
10. Retirar la mayor cantidad de sobrenadante invirtiendo el tubo, si queda aún quedasobrenadante retirar suavemente con pipeta.µ
11. Re suspender suavemente las células en 200mL de buffer CCMB80 (buffer debe estar en frio), una vez suspendido agregar 60mL de buffer CCMB80, agitar e incuba por 20 minutos en hielo.
12. Centrifugar durante 10 minutos a 4°C. leer DO a 600nm. (leer del sobrenadante )
13. Retire el sobrenadante (paso 10) y resuspender en 10 ml de CCMB80 (buffer debe estaren frio).
14. Transferir 200µL de SOB a un tubo y añadir 50µL de E.coli suspendido (unir evitado el burbujeó).
15. Calcular la cantidad de buffer CCMB80 requerido para ajustar la DO de la suspensión bacteriana a 1.0 - 1.5. añadir la cantidad requerida a la suspensión.
16. Incubar la suspensión diluida durante 20 minutos
17. Tomar alícuotas de 50µL en 2mL en tubos pre enfriados de 2 ml contornillo superior para congelación. Congelar la suspensión como antes (paso 5, más arriba).
18. Probar las células competentes como se describe a continuación.
19. Ajustar un baño de agua a la temperatura de 42°C .
20. Diluir 1µg del plásmido de prueba en 100mL de TE (pH 7.6). La concentración de ADN plasmidial en la solución diluida debe ser 10-5 µg/µL. Guarde la solución de ADN en hielo necesario(paso 22).









21. Descongelar 50 µL de las células competes de la siguiente manera: tome los tubos congelado en hielo a -80 ° C. Descongelar las células poniendo el tubo en la palma de la mano. Cuando las células estén descongeladas , transferir el tubo en el recipiente de hielo
22. Poner toda la alícuota descongelada en un tubo falcón pre enfriado y añadir 1µL de ADN diluido. Agitar entubo suavemente y almacenar por 30 min en hielo. (una vez descongeladas las células transformadas deben desecharse, ya que el re congelamiento significa una caída significativa en su eficiencia).
23. Trasferir el tubo a un baño de agua a 42°C durante EXACTAMENTE 60 segundo. ( El golpe de calor es un paso crucial. Es muy importante que las células estén exactamente a la temperatura adecuada. Lostiempos de incubación y las temperaturas que se dan aquí se han elaborado utilizando tubos falcón y volúmenes de 50 µL. Otros tipos de tubos no podrá producir resultados equivalentes. )
24. Añadir 250µL de medio SOC e incubar el tubo durante 60 minutos en un shaker temperatura ambiente (37°C).
25. Adicionar 25µL de la mezcla de transformación sobre las placas de agar precalentadas y con elantibiótico apropiado y disponer de las colonias bien separadas, poner el inoculo de manera uniforme sobre la superficie de la placa usando una pipeta pasteur, o perlas de vidrio como sique abajo.
i) Utilizando un pequeño embudo, transferir cuatro a seis perlas de vidrio en cada una de las series de tubo. (Esterilizar las perlas en autoclave).
ii) Después de que el inoculó se trasfiere sobre el agar,...