Protocolo metodologia
Páginas: 30 (7487 palabras)
Publicado: 24 de noviembre de 2010
Determinación del contenido proteico del veneno de serpientes del genero Crotalus Durissus aplicando el método de Lowry en espectrofotometría UV/VIS.
Objetivo general:
* Cuantificar el contenido proteico del veneno del genero de serpientes Crotalus Durissus mediante el uso de la técnica de Lowry aplicando espectrofotometría UV/VIS.
Objetivo particular:
* Determinar si elmétodo de Lowry es eficaz para realizar la cuantificación del contenido proteico.
* Conocer su aplicación junto con la técnica de espectrofotometría UV/VIS.
* Averiguar si existe alguna problemática con la aplicación de este método.
* Evaluar el contenido proteico para dar la pauta a la elaboración de un suero antiviperino polivalente para tratar la mordedura de serpientes del géneroCrotalus Durissus en México.
Hipótesis:
Mediante la aplicación experimental del método de Lowry se pude lograr la cuantificación de las proteínas del género de serpientes Crotalus Durissus, ya que se ha comprobado que en estudios para la cuantificación del contenido proteico de serpientes Bothrops este método ha ofrecido buenos resultados.
Planteamiento del problema:
Debido a queen nuestro país la mordedura de serpientes causa algunos problemas para la vida de los seres humanos, se decide analizar mediante la técnica de espectrofotometría UV/VIS el veneno de las serpientes del género Crotalus Durissus, para cuantificar el contenido proteico de su veneno, ya que en México es muy difícil resolver los problemas causados por esta y los 12 subgéneros que existen de estegénero de Crotalus en nuestro país.
Metodología:
VENENO
Se utilizara el veneno de la serpiente Crotalus Durissus, el cual será obtenido de dos especímenes de edad adulta y sanos por no mostrara ninguna anormalidad en las escamas. Se lo extrajo, previa anestesia de los animales con dióxido de carbono, por compresión manual de las glándulas de veneno, en recipiente de vidrio esterilizado.
Elveneno fue desecado y conservado a -20º C hasta el momento de ser utilizado.
PREPARACIÓN DE LA CURVA ESTÁNDAR A BASE DE SERO ALBÚMINA BOVINA (BSA)
La solución Stock de sero albumina bovina debe ser preparada aproximadamente una hora antes de realizar el análisis ya que esta tarda en disolverse por completo en el agua. Para este caso se utilizaran 0.05 g de BSA y se aforaran a 500 ml con aguadestilada, la concentración final de la solución stock deberá ser de 100 mg BSA/L (Rosenbroug, 1995).
Se prepara una curva de calibración estándar en la cual se elaborara en base a la siguiente tabla:
Volumen de agua destilada en ml | Volumen de la solución stock de BSA en ml | Concentración final en mg/L |
10 | 0 | 0 |
8 | 2 | 20 |
6 | 4 | 40 |
4 | 6 | 60 |
2 | 8 | 80 |
0 | 10 |100 |
PREPARACION DEL REACTIVO DE LOWRY
Solución A (solución alcalina): para 500 ml de agua destilada, se utilizaran 2.85 g de NaOH, y 14.30 g de Na2CO3. Para la Solución B, para 100 ml de agua destilada, se utilizaran 1.42 g de CuSO4.5(H2O) y por último, la Solución C, para 100 ml de agua destilada y 2.85 g de Na2 Tratado.2(H2O) (Rosenbroug, 1995).
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
30 mg deveneno de Crotalus Durissus se disolvieron en 1 ml de buffer Tris-HCl 0.01 M, pH= 7,5. Posteriormente se tratara con los reactivos de Folin y la solución de Lowry.
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
El contenido proteico de cada veneno será determinado tanto por la absorbancia en el rango de luz ultravioleta a 280 nm, en un espectrofotómetro UV/VIS. Así mismo se determinó también el contenidoproteico por el método de Lowry; para ello se utilizó una solución alcalina, el reactivo de Folin Ciocalteus y la albúmina sérica bovina como proteína estándar, se midió la absorbancia a 660 nm (Yarlenque y Vivas, 2008).
Estadístico utilizado
Para la curva de calibración se utilizara la Regresión Lineal, en el caso de la cuantificación de proteínas se recurrirá al análisis de varianzas y a la...
Objetivo general:
* Cuantificar el contenido proteico del veneno del genero de serpientes Crotalus Durissus mediante el uso de la técnica de Lowry aplicando espectrofotometría UV/VIS.
Objetivo particular:
* Determinar si elmétodo de Lowry es eficaz para realizar la cuantificación del contenido proteico.
* Conocer su aplicación junto con la técnica de espectrofotometría UV/VIS.
* Averiguar si existe alguna problemática con la aplicación de este método.
* Evaluar el contenido proteico para dar la pauta a la elaboración de un suero antiviperino polivalente para tratar la mordedura de serpientes del géneroCrotalus Durissus en México.
Hipótesis:
Mediante la aplicación experimental del método de Lowry se pude lograr la cuantificación de las proteínas del género de serpientes Crotalus Durissus, ya que se ha comprobado que en estudios para la cuantificación del contenido proteico de serpientes Bothrops este método ha ofrecido buenos resultados.
Planteamiento del problema:
Debido a queen nuestro país la mordedura de serpientes causa algunos problemas para la vida de los seres humanos, se decide analizar mediante la técnica de espectrofotometría UV/VIS el veneno de las serpientes del género Crotalus Durissus, para cuantificar el contenido proteico de su veneno, ya que en México es muy difícil resolver los problemas causados por esta y los 12 subgéneros que existen de estegénero de Crotalus en nuestro país.
Metodología:
VENENO
Se utilizara el veneno de la serpiente Crotalus Durissus, el cual será obtenido de dos especímenes de edad adulta y sanos por no mostrara ninguna anormalidad en las escamas. Se lo extrajo, previa anestesia de los animales con dióxido de carbono, por compresión manual de las glándulas de veneno, en recipiente de vidrio esterilizado.
Elveneno fue desecado y conservado a -20º C hasta el momento de ser utilizado.
PREPARACIÓN DE LA CURVA ESTÁNDAR A BASE DE SERO ALBÚMINA BOVINA (BSA)
La solución Stock de sero albumina bovina debe ser preparada aproximadamente una hora antes de realizar el análisis ya que esta tarda en disolverse por completo en el agua. Para este caso se utilizaran 0.05 g de BSA y se aforaran a 500 ml con aguadestilada, la concentración final de la solución stock deberá ser de 100 mg BSA/L (Rosenbroug, 1995).
Se prepara una curva de calibración estándar en la cual se elaborara en base a la siguiente tabla:
Volumen de agua destilada en ml | Volumen de la solución stock de BSA en ml | Concentración final en mg/L |
10 | 0 | 0 |
8 | 2 | 20 |
6 | 4 | 40 |
4 | 6 | 60 |
2 | 8 | 80 |
0 | 10 |100 |
PREPARACION DEL REACTIVO DE LOWRY
Solución A (solución alcalina): para 500 ml de agua destilada, se utilizaran 2.85 g de NaOH, y 14.30 g de Na2CO3. Para la Solución B, para 100 ml de agua destilada, se utilizaran 1.42 g de CuSO4.5(H2O) y por último, la Solución C, para 100 ml de agua destilada y 2.85 g de Na2 Tratado.2(H2O) (Rosenbroug, 1995).
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
30 mg deveneno de Crotalus Durissus se disolvieron en 1 ml de buffer Tris-HCl 0.01 M, pH= 7,5. Posteriormente se tratara con los reactivos de Folin y la solución de Lowry.
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
El contenido proteico de cada veneno será determinado tanto por la absorbancia en el rango de luz ultravioleta a 280 nm, en un espectrofotómetro UV/VIS. Así mismo se determinó también el contenidoproteico por el método de Lowry; para ello se utilizó una solución alcalina, el reactivo de Folin Ciocalteus y la albúmina sérica bovina como proteína estándar, se midió la absorbancia a 660 nm (Yarlenque y Vivas, 2008).
Estadístico utilizado
Para la curva de calibración se utilizara la Regresión Lineal, en el caso de la cuantificación de proteínas se recurrirá al análisis de varianzas y a la...
Leer documento completo
Regístrate para leer el documento completo.