Protocolo microbiologia









Protocolos para análisis microbiológico muestras de agua y sedimento de Rio Loa





Integrantes: Javiera Collao T.
ArletteLetelier
Mª Francisca Luza
Karen Perez
Cristian Sepúlveda M.Profesor: Fernando Silva
Asignatura: Microbiología II







3 de Octubre de 2012
1.- Toma de muestras
Las muestras corresponderán a Agua y sedimentos tomadas de Rio Loa, zona ubicada geográficamente cerca de Mª Elena.
2.- preparación medios de cultivos
El aislamientode microorganismos se realizó en cuatro medios de cultivo: TSA (OXOID), TCBS (marca) preparados de acuerdo a las indicaciones del fabricante, y el medio de algas nombre; redactar materiales Agar agar (Merck) 20gr/L y un litro de agua destilada, todos los medio se autoclavaron a 121 ºC. Para la obtención de cultivos axénicos primero se realizó una siembra directa (y en algunos casos condiluciones) con rastrillo de las muestras tomadas, y luego se sembró de forma estríada los distintos morfotipos, realizando tres traspasos en cada uno. Todos los aislados fueron preservados en Glicerol 10% y DMSO 5% (por separado) y guardados a -20ºC. Falta lo de siembra de sedimento

3.- Procesamiento muestra
3.1.-Siembra muestras
3.2.-recuento celular
3.5.-recuento de heterótrofos3.3.-caracterización morfotipos a nivel maro y microbiológico
3.4.- caracterización bioquímica
4.- Análisis moleculares
4.1.- Extracción DNA
4.1.1 Kit comercial

Se realizo mediante el kit PowerSoil DNA Isolation (MoBio) en el cual se siguieron los siguientes pasos:

-En los tubos PowerBead colocar 0.25g de suelo o 50-100µL de muestra liquida.
-Vortear suavemente para mesclar.
-Agregar 60µL desolución C1 e invertir varias veces o agitar brevemente.
-Asegurar los tubos PawerBead horizontalmente en el vortex, vortear a máxima velocidad durante 10 minutos.
-Centrifugar los tubos a 10000g por 30 segundos a temperatura ambiente.
-Transferir el sobrenadante a tubos de 2mL limpios.
-Añadir 250µL de la solución C2 y vortiar durante 5 segundos. Incubar durante 5 minutos.
-Centrifugar los tubosa temperatura ambiente durante 1 minuto a 10000g.
-Tomar el sobrenadante, evitando el pellet, no más de 600µL de sobrenadante a un tubo limpio de 2mL.
-Añadir 200µL de la solución C3 y agitar brevemente. Incubar a 4ºC durante 5 minutos.
-Centrifugar los tubos a temperatura ambiente durante 1 minuto a 10000g.
-Evitando el pellet, transferir no más de 750µL de sobrenadante a un tubo limpio de2mL.
-Agitar solución C4 antes de su uso y añadir 1200µL de solución C4 al sobrenadante y agitar durante 5 segundos.
-Cargar aproximadamente 675µL en un Spin Filter y centrifugar a 10000g durante 1 minuto a temperatura ambiente. Desechar el flujo y agregar 675µL de sobrenadante, centrifugar a 10000g por 1 minuto a temperatura ambiente. Cargar todo el sobrenadante restante y centrifugar a 10000gpor 1 minuto a temperatura ambiente.
-Añadir 500µL de solución C5 y centrifugar a temperatura ambiente durante 30 segundos a 10000g.
-Desechar el flujo.
-Centrifugar de nuevo a temperatura ambiente durante 1 minuto a 10000g.
-Colocar cuidadosamente el Spin Filter en un tubo limpio de 2mL. Evitar salpicaduras cualquier salpicadura de solución C5 en el Spin Filter.
-Añadir 100µL de solución C6...