Protocolo para el aislamiento de cloroplastos en plantas de musa

Protocolo

Biotecnología Vegetal Vol. 10, No. 1: 49 - 52, enero - marzo, 2010 ISSN 1609-1841 (Versión impresa) ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)

Protocolo para el aislamiento de cloroplastos intactos de hojas de plantas de Musa spp. obtenidas por cultivo in vitro y evaluación de la actividad fotosintética
Michel Leiva-Mora*, Yelenys Alvarado-Capó, Mayra Acosta-Suárez, MileidyCruz-Martín, Cynthia Sánchez-García, Berkis Roque. *Autor para correspondencia
Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP), Universidad Central ‘Marta Abreu’ de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5, Santa Clara, Villa Clara, Cuba. CP 54 830 e-mail: michel@ibp.co.cu RESUMEN Los cloroplastos son los orgánulos de las células vegetales donde se realiza la fotosíntesis, al convertir la energía lumínica enenergía química (ATP) y generar poder reductor (NADPH). El aislamiento de cloroplastos y la evaluación de la actividad fotosintética en condiciones in vitro, ha sido una tarea difícil debido a las alteraciones estructurales y funcionales que sufren los cloroplastos y a la presencia de fracciones celulares contaminantes. En el presente trabajo se propone un protocolo para el aislamiento decloroplastos de hojas de bananos, así como un procedimiento para la evaluación de la actividad fotosintética de dicha suspensión. En él se resumen los principales reactivos, soluciones, materiales biológicos, equipos, y condiciones necesarias para reproducirlo en condiciones de laboratorio. Finalmente, se sugieren diversas aplicaciones que puede tener el presente protocolo en el campo de la enseñanza einvestigación científica relacionada con la biotecnología vegetal. Palabras clave: 2,6-diclorofenolindofenol, equivalentes reductivos, fotosíntesis, reactivo de Hill ABSTRACT Chloroplasts are organelles of plant cells where photosynthesis takes place by converting light energy into chemical energy (ATP) and generating reducting power (NADPH). Isolation of chloroplasts and evaluation ofphotosynthetic activity in vitro has been a difficult task due to structural and functional changes suffered by chloroplasts during their isolation and the presence of contaminating cell fractions. In this paper we propose a protocol for the isolation of chloroplasts from banana leaves and a procedure for the evaluation of the photosynthetic activity of chloroplast suspension. The main reagents, solutions,biological materials, equipment, and conditions necessary to reproduce it in laboratory conditions are summarized. Finally, several applications of this protocol are suggested to be used in teaching and scientific research related to plant biotechnology. Key words: 2,6-dichlorophenol-indophenol, Hill reaction, photosynthesis, reductive equivalents

INTRODUCCIÓN Los cloroplastos, son orgánulossubcelulares (plastidios) verdes, con un diámetro que puede variar desde 5 a 10 μm. Están presentes en las células mesofílicas de las hojas o en cualquier otro tejido vegetal con capacidad fotosintética. Las angiospermas pueden contener de 15 a 20 cloroplastos por célula fotosintética. Hasta el 50% de la proteína foliar puede estar contenida en los cloroplastos. Su forma y tamaño varía en dependenciade la especie vegetal. Los cloroplastos se originaron como organismos endosimbióticos en la célula eucariota primitiva y poseen una autonomía genética parcial, al contener ácido desoxiribonucleíco (ADN), ácido

ribonucleíco (ARN) y toda la maquinaría enzimática de replicación, transcripción y traducción (Barceló et al., 2007). Una suspensión de cloroplastos aislados puede desprender O2 enpresencia de luz, si se suministra un compuesto oxidado capaz de aceptar electrones procedentes de la fotolisis del agua. De esta forma, el proceso de desprendimiento de O2 en la fotosíntesis puede ser separado del de la fijación de CO 2 (Kozuleva e Ivanov, 2010). En la hoja intacta, los principales aceptores naturales de electrones son la ferredoxina y el NADP, pero se inactivan durante el proceso...