Protocolo para Extracci n de RNA de Symbiodinium

Protocolo para Extracción de RNA de Symbiodinium

Tejido Macerado por perlas de vidrio o ruptura por nitrógeno líquido.

1 Agregar 1ml de Trizol al tubo eppendorf y se agrega la muestra triturada,vortexear y después centrifuga a 12000rpm durante 10 min a 4°C.
2 Separar el sobrenante en otro tubo y dejar 10 minutos a 30°C (T ambiente) y enseguida añadir 200µl de cloroformo por cada ml detrizol.
3 Tapar las muestras y agitar fuertemente por 1 min, incube a T Ambiente de 2 a 5 minutos y centrifugar muestras a 12000rmp por 15 min a 4°C, se observaran 3 fases.A) Fase incolora es donde está la RNA.B) Fase Intermedia donde está el ADN y proteínas.C) Fase color rojo, es la fase orgánica.4 Transfiere la fase acuosa a un tubo limpio y guarde la fase orgánica a 4°C para aislar el ADN y proteínas posteriores si es necesario.
5 Añadir 250µl de citrato de sodio a 0.8M y 1.2M de NaCl,mezclar e incubar a -20°C por 15 a 20min, centrifugar 12K por 10min a 4°C.
6 Remover el sobrenadante, lavar el pellet de RNA una vez con 75% de etanol (1ml) y mezclar por vortex, centrifugar a 7500 por 5minutos a 4°C.
7 Dejar secar el pellet brevemente y disolver en 100µl de H2O DEPC. Pipetear suavemente, después centrifugar incubar a 55°C por 10 minutos.
8 Separar el sobrenante en otro tubo y dejar10 minutos a 30°C (T ambiente) y enseguida añadir 200µl de cloroformo, sin trizol.
9 Tapar las muestras y agitar fuertemente por 1 min, incube a T Ambiente de 2 a 5 minutos y centrifugar muestras a...