protocolo para obtencion de adn de bacterias patogenas

1. OBTENCIÓN DE ADN DE BACTERIAS PATÓGENAS

Existen diferentes métodos para la obtención de ADN bacteriano que varían en
duración y complejidad del procedimiento en función de la calidad del ADN que
queramos obtener. En este apartado definimos dos métodos para extracción de ADN
cromosómico como el método de hervido, que es un método rápido, pero con el que se
obtiene un ADN de pureza mínima, perosuficiente para llevar a cabo procedimientos
como la técnica de PCR; y el método de CTAB, más largo pero con el que se obtiene un
ADN de mayor pureza útil para análisis posteriores con enzimas de restricción. Además,
se incluye un protocolo comercial de extracción de ADN plasmídico adaptado para
Acinetobacter baumannii.

1.1. MÉTODO DE HERVIDO
Materiales
- Cultivo bacteriano en placa de agar
-Asa de siembra
- Estufa a 37 ºC
- Eppendorf de 1,5 ml estériles
- Pipetas y puntas desechables estériles
- Placa calefactora con capacidad de alcanzar 100ºC
- Centrífuga
Soluciones
- Agua molecular autoclavada

MATERIALES Y
SOLUCIONES

Protocolo
1. Preparar un eppendorf estéril por cada muestra al que se añaden 100 µlitos de
agua molecular autoclavada.
2. Tomar con un asa de siembra unas coloniasde la placa de agar e introducirlas en
el eppendorf, utilizando posteriormente la pipeta para obtener una suspensión
homogénea.
3. Calentar a 100ºC durante 15 minutos.
4. Añadir 900 µlitros de agua molecular estéril a cada eppendorf y homogeneizar.
5. Centrifugar durante 5 minutos a 12.000 rpm
6. Recoger el sobrenadante en un eppendorf estéril.

Para cada reacción de PCR se añaden de 1-5 µl de estesobrenadante.

1.2. OBTENCION DE ADN GENÓMICO PURO
Materiales
- Cultivo bacteriano en placa de agar
- Asa de siembra
- Pipetas y puntas desechables estériles
- Eppendorf de 1,5 ml estériles
- Centrífuga

Soluciones
- Cloroformo: isoamilalcohol: Mezclar cloroformo e isoamilalcohol en
proporción 24: 1
- Fenol/cloroformo: isoamilalcohol: Mezclar en proporción 1: 1 fenol
neutro saturado y cloroformo:isoamilalcohol (24:1) (v/v)
- CTAB/NaCl: Mezclar Hexadecyltrimethylammonium Bromide al 10 % y
NaCl 5M en proporción 1:1. Mantener a temperatura ambiente.
- Solución RNAsa (10 mg/ ml):Disolver en agitación 100 mg del enzima
en 10 ml de agua destilada, calentar a 90 ºC durante 10 minutos para desactivar
las DNAsas. Alicuotar y guardar a – 20 ºC.

- Solución Proteinasa K (20 mg/ ml): Disolver enagitación 100 mg de
proteinasa K en 5 ml de agua destilada estéril. Alicuotar y guardar a – 20 ºC.
- TE pH 8.0: 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA. Autoclavar y mantener a
temperatura ambiente.
- SDS al 10 % (p/v): Disolver 10 g de SDS en 100 ml de agua destilada.
Mantener a temperatura ambiente.
- NaCl 5M: Disolver 292.2 g de NaCl en un volumen final de 1 litro.
Autoclavar.
-

Agua molecular autoclavazaProtocolo
1. Resuspender un asa de colonias de una placa de agar en 500 µl de TE hasta
conseguir una perfecta homogeneización.
2. Añadir 30 µl de SDS al 10 % y mezclar bien
3. Añadir 3 µl de proteinasa K (20 mg/ml) e incubar 60 minutos a 37 ºC
4. Añadir 100 µl de NaCl 5 M, mezclar haciendo espuma y añadir 80 µl de
CTAB/NaCl, mezclar volteando el tubo e incubar durante 10 minutos a 65 ºC
5. Añadir unvolumen de la solución fenol/cloroformo:isoamilalcohol (25/24:1),
mezclar volteando el tubo y centrifugar 5 minutos a 8000 rpm. Extraer la fase
superior procurando no tocar la interfase.
6. Repetir el paso 5

7. Añadir RNAsa a una concentración final de 50 µg/ml e incubar durante 30
minutos a 37 ºC
8. Repetir el paso 5
9. Extraer con igual volumen de cloroformo: isoamilalcohol (24:1). Voltear,centrifugar y extraer la fase superior. Hay que tener en cuenta el volumen que se
recupera.
10. Precipitar con 1/10 volúmenes de acetato sódico y 2 volúmenes de etanol helado
a -20º C o/n o a -80º C 1 hora.
11. Centrifugar a 12.000 rpm durante 20 minutos.
12. Retirar el etanol y dejar secar a 37 ºC.
13. Resuspender en 50-200 microlitros de TE y conservar a -20 ºC

Para utilizarlo en análisis...