Protocolo Pcr

Optimización de la técnica Reacción de Polimerasa en Cadena para el diagnóstico simultáneo de Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae en el Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia en Managua, Nicaragua
Organismos Escogidos
Se ha desarrollado la reacción de polimerasa en cadena (PCR) múltiple para la detección simultánea de Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae.
¿Qué causanestas enfermedades?
La Chlamydia trachomatis es un causante frecuente de uretinitis no gonococica y epididimitis en los varones de los cuales, del 20 al 50% permanecen sintomáticos. En las mujeres causa cervicitis, salpingitis, endometritis y enfermedad inflamatoria pélvica. Más del 70% de las mujeres son asintomáticas. Los recién nacidos pueden adquirir la infección durante el parto y puedensufrir síntomas oculares y trastornos respiratorios.
La Neisseria gonorrhoeae ataca la mucosa de las vías genitales, los ojos, el recto y la garganta produciendo supuración aguda con invasión tisular, culminando con inflamación crónica y fibrosis. En las mujeres produce endocervitis con la posterior obliteración de las Trompas de Falopio. La esterilidad ocurre en el 20% de las mujeres que han sufridode salpingitis gonococica. La oftalmia neonatal gonococica, es un trastorno frecuente en recién nacidos infectados, que puede progresar con rapidez a ceguera.
Metodología
Tanto el ADN de Chlamydia trachomatis como el ADN de Neisseria gonorrhoeae fueron extraídos hirviendo durante 10 minutos las muestras de exudado en Chelex 100
Se tomaron exudados vaginales a 1,811 mujeres trabajadorassexuales. A cada paciente se le tomaron cuatro muestras de frotis de hisopos: la primera fue destinada para una tinción de Papanicolaou; la segunda para cultive en agar Thayer-Martin; la tercera para ensayo inmuno-enzimático (EIA); y la cuarta para PCR. Las 1,811 muestras fueron procesadas primeramente por cultivo en agar Thayer-Martin y EIA. Luego todas las muestras positivas y el 10% de las negativasfueron procesadas por PCR. Se evaluó el medio de transporte optimo para las muestras a procesarse por PCR estudiando 124 muestras recolectadas en 2-sucrosa fosfato (2-SP) y Chelex 100. Se determinó la dilución optima del extracto a ser procesado por PCR estudiando 134 muestras sin dilución y diluidas 1:5 en agua destilada.
* PCR simultáneo vs PCR separado
Se obtuvo que en la PCR para ladetección de Chlamydia trachomatis por separado se detectaron 23 muestras positivas y en cambio, al realizar el PCR simultáneo, se detectaron 22 muestras positivas. Con respecto a la detección de Neisseria gonorrhoeae por la PCR separado se detectaron 23 muestras positivas y por PCR simultáneo, 19 muestras positivas. Todas las muestras positivas por PCR simultáneo fueron captadas por PCR separado.
*PCR vs técnicas de referencias
Para comparar la sensibilidad y especificidad del PCR con técnicas de referencia (EIA para Chlamydia trachomatis y cultivo en agar ThayerMartin para Neisseria gonorrhoeae) se analizaron 413 muestras endocervicales para la deteccion de Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae.
* PCR vs ELISA para la detección de Chlamydia trachomatis
Se procesaron 413muestras por ELISA para la deteccion de antigeno Lipopolisacárido de Chlamydia trachomatis y por PCR en el que se utilizaron cebadores KL1 y KL2. Como resultado, se detectaron 91 muestras positivas y 322 negativas para ELISA. De estas muestras 67 fueron positivas y 296 negativas por ambas técnicas: 24 fueron ELISA positivas y PCR negativas y 26 fueron ELISA negativas y PCR positivas, para unaconcordancia del 87.8%. Tomando ELISA como estandard, la sensibilidad y especificidad del PCR es del 73.6% y 91.9%, respectivamente.
Para confirmar los resultados del grupo de 26 muestras ELISA negativo y PCR positive, se realizó digestión con enzimas de restricción Hind III a todos los productos de amplificación obteniendo que: 21 de las 26 muestras eran realmente positivas por PCR. Además, a las...