protocolo purificacion

Protocolo western blot.
1. Correr la proteína a analizar en un gel de poliacrilamida desnaturalizante 10% por duplicado. Uno de los geles teñirlo con la tinción de comassie coloidal 0.06%.

1.Transferencia
Humedecer la membrana de nitrocelulosa y el papel filtro con el buffer de transferencia
Equilibrar el gel por 15 minutos con el buffer towblin
Colocar el papel humedecido sobre laplaca de transferencia evitando la formación de burbujas y posteriormente colocar la membrana de nitrocelulosa evitando tocarla.
Poner el gel encima de la membrana sin que forme burbujas y colocar elsegundo papel filtro
Colocar la tapa de la cámara de transferencia y correr por 30 minutos a 10 volts.
Transcurrido el tiempo retirar la membrana y teñirla con la solución de ponceau para visualizar latransferencia de proteínas.
Lavar la membrana hasta eliminar todo el colorante
Lavar nuevamente la membrana con PBS 1x por 10 minutos.
Incubar la membrana con la solución de bloqueo durante todala noche con agitación constante.
Lavar 3-4 veces, 5 minutos la membrana con PBS 1x.
Incubar la membrana con la solución que contiene el anticuerpo primario durante 8 hrs a temperatura ambiente conagitación constante.
Lavar la membrana 4-5 veces por 5 minutos con la solución de lavado.
Incubar la membrana con la solución del anticuerpo secundario durante 2 horas con agitación constante.
Lavarnuevamente con la solución de lavado durante 5 minutos, 4-5 veces.
Lavar 2 veces con el buffer AP durante 5 minutos.
Agregas la solución de revelado a la membrana y dejar reaccionar de 5-10minutos.
Detener la reacción con agua destilada y dejar secar la membrana.

2. Soluciones
Buffer de transferencia towbin (1L)
5.8 g Tris-BASE
2.9 g glicina
200 ml metanol
3.7 ml SDS 10%
Rojo dePonceau (10 ml)
0.05 g de ponceau xilidina
500 ml acido acético glacial.
Aforar con agua destilada.
Buffer de fosfatos (PBS) 20 x pH 7.5 (500 ml)
81.81 g NaCl
3.86 g NaH2PO4-H2O
10.22 g NaH2PO4...