Protocolo

1 Protocolo de extracción de ADN de plantas basado en CTAB (Ensayado en yuca)
Nota: la extracción se hace en tubos de 15mL 1. Materiales -Pipetas de 2-20uL, de 20-200uL y de 100-1000ul -Baño deMaría -Agitador para bandejas -Recipiente para hielo -Centrifuga para tubos de 1,5 ml, que alcance 14000 rpm -Mortero y mazo para macerar tejidos -Congelador (-20°C) -Cámara de electroforesis horizontal-Tubos de 15ml -Tubos de 1,5ml -Guantes de látex -Campana de extracción 2. Reactivos -Nitrógeno líquido -Tris-HCL 1M pH8,0 -EDTA 0,5M pH8,0 -CTAB -NaCl 5M -B-ercaptoetanol -Cloroformo:octanol (24:1)-PVP(Polyvinyl Pyrrolidone) -Etanol -TE (10:1) -RNasa 3. Preparación de soluciones A) Buffer de extracción Reactivo Tris-HCl (pH=8.0) EDTA (pH=8.0) CTAB NaCl (opcional) B-mercaptoetanol

Concentraciónen solución 100mM 20mM 2,0% 1,4mM 2,0%

Nota: Mezcle los siguientes reactivos. Luego, complete el volumen con agua bidestilada y esterilice en el autoclave. Agregue el -mercaptoeltanol antes deusar.

Protocolos de laboratorio UEG 2009

Por: Duina Posso Duque

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B) T10E1 Reactivo Tris-HCl (pH=8.0) EDTA (pH=8.0) Concentración en solución 10mM 1mM

Nota: Completar el volumen con aguadestilada, autoclavar y guardar al 4°C. 4. Protocolo 1. Pese 0,5 g de tejido macerado 2. Agregue 5 mL de buffer de extracción precalentado a 37ºC. 3. Agregue 50mg de PVP y mezcle invirtiendo el tubo.4. Incube a 60ºC durante 25 min y deje que alcance la temperatura ambiente. 5. Agregue 6mL de cloroformo:octanol (24:1 (v/v)): Mezcle suavemente invirtiendo el tubo unas 20 a 25 veces hasta que seforme una emulsión. Trabaje en campana de extracción. 6. Centrifugue a 6000 rpm por 15 min a temperatura ambiente. 7. Transfiera la fase acuosa (la de arriba a un nuevo tubo) con una pipeta. Si la faseacuosa es turbia repita el paso 5. Trabaje en campana de extracción. 8. Agregue 0,5 volúmenes de 5M NaCl a la solución acuosa y mezcle bien. 9. Agregue 2 volúmenes de etanol al 95% refrigerado. 10....