Protocolos Bm3

Kit para determinación de proteínas
Método de Bradford
La determinación de proteínas por el método de Bradford consiste en la cuantificación de la unión de un colorante, el
Azul de Coomassie G-250, ala proteína, comparando esta unión con la de diferentes cantidades de una proteína
estándar (Albúmina de Suero Bovino (BSA)). La cuantificación se hace midiendo la absorbancia en unespectrofotómetro, a 595 nm, y graficando la absorbancia vs la concentración de proteínas, obteniendo una curva de
calibración de la proteína estándar. Con esta curva de calibración, se puede interpolar laconcentración de proteínas
en una muestra al medir su absorbancia a 595 nm.
Contenido:
1 Reactivo de Bradford 1x
2 Solución de dilución
3 Estándar de proteína (BSA 0.5 mg/ml)

250 mL
100 mL
2 mL

Almacenaje:Reactivo de Bradford 1x: 2-8ºC; Solución de Dilución: TA y Estándar de Proteína: -20ºC.
Procedimiento:
1- Prepare diluciones del estándar de proteína de 25, 50, 75 y 100 g/mL, usando la solución dedilución:
En 4 tubos tipo Eppendorf, añada 5, 10, 15 y 20 L del estándar de proteína (0.5 mg/mL) y complete el
volumen de 100 L con la solución de dilución.
En otro tubo añada 100 L de la solución dedilución. Este es el blanco.
2- Prepare la(s) muestra(s) tomando un volumen igual o menor a 100 L; completando los 100 L con la solución
de dilución.
3- Añada a cada tubo 1 mL del reactivo de Bradford,mezcle con agitador vórtex, e incube la reacción a
temperatura ambiente por 2 minutos.
4- Mida la absorbancia a 595 nm (A595) en un espectrofotómetro, en un plazo no mayor de 1 hora.
5- Haga la curvade calibración estándar graficando la A595 vs la concentración de proteína estándar.
6- Determine la concentración de proteína en las muestras a partir de la curva de calibración estándar y losvalores
de A595. Si la concentración es muy alta (queda fuera del rango del estándar), diluya la muestra o tome una
alícuota menor para la determinación.

Referencias:
Bradford, M. M. (1976): A rapid...