Protocolos de Biología celular
































CONTENIDO





















Electroforesis de células individuales (linfocitos) “Ensayo Cometa”
REACTIVOS
Preparación de Agarosa regular al 0.65%
Agar (gr)
Cantidad de agua destilada (mL)
0.325
50
0.162
25
0.13
20
0.0975
15
0.065
10
0.0325
5

Preparación de laminillas con Agarosa regular al 0.65%
Depositar 140 µL de agarosa regular en un porta objetos limpio(esmerilado) y estender con el ddo indice sobre todo el cubre objetos.
Dejar secar las laminillas en la estufa a 80°C.
Preparación de Agarosa de bajo punto de fusión (LMPA) al 1%
Agar (gr)
Cantidad de agua destilada (mL)
0.50
50
0.25
25
0.20
20
0.15
15
0.1
10
0.05
5

Solución de lisis 1
(2.5M NaCl, 100mM (0.1M) EDTA, 10% DMSO, 1% Triton) · (100)
Cantidad de agua destilada (mL)
NaCl (gr)
EDTA (gr)Tris-HCl (gr)
1000
146.44
37.02
1.20
500
73.22
18.51
0.604
250
36.61
9.257
0.302
150
21.96
5.55
0.181
100
14.64
3.70
0.120
50
7.32
1.85
0.060
25
3.36
0.92
0.030
Ajustar pH 10.

Preparación del cöplin
Agregar un volumen de 28 mL (solución de lisis 1 + 2.8 mL de DMSO + 280 µL de Triton). Mantener a 4°C/ 4 h.

Solución de electroforesis
(NaOH 300mM, EDTA 200mM)
Cantidad de agua destilada (mL)
NaOH(gr)
EDTA (gr)
1000
12
58.44
500
6
29.22
250
3
14.61
150
1.8
8.766
100
1.2
5.844
50
0.60
2.922
25
0.30
1.461
Ajustar pH 13. Mantener a 4°C/ 10 min., en un lugar oscuro.
Realizar electroforesis a 25V y 300mA/ 20 min.

Solución neutralizante
(0.4M Tris-HCl)
Cantidad de agua destilada (mL)
Tris-HCl (gr)
1000
48.456
500
24.228
250
12.114
150
7.286
100
4.857
50
2.428
25
1.214
Ajustar pH 7.5. Mantner enrefrigeración constante a 4°C.

PROCEDIMIENTO
1. Preparar los portaobjetos con agarosa regular al 0.65%, y secar a 85°C.
2. Preparar el volumen indicado de agarosa de bajo punto de fusión al 1% a 37°C.
3. Pipetear una alicuota de 80µL (20µL de la muestra (rango de concentración celular de la muestra 5 - 10 million mL-1.) + 80µL de LMPA) y depositarla en las laminillas pretratadas al 0.65%.
4.Cubrir la muestra depositada con un cubreobjetos.
5. Dejar solidificar a 4°C por 4 min.
6. Retirar cuidadosamente el cubreobjetos de la laminilla.
7. Los portaobjetos son colocados dentro del cöplin con la preparación de lisis, a 4°C/ 24h.
8. Posteriormente se raliza una corrida electroforética a 25V y 300mA/20 min, con un tiempo previo de reposo de 20 min.
9. Una vez terminada la electroforesis, laslaminillas son enjuagadas con agua destilada y solución neutralizante de manerera cuidadosa para asegurar la integridad de la agarosa.
10. Finalmente son deshidratadas con metanol puro y se dejan secar al ambiente.
11. Una vez secas se procede a la tinción con colorante Gel Green™ agregando un volumen de 35 µL (concentración 0.62 µL/ mL de agua destilada) por laminilla.
12. Cubrir con uncubreobjetos y dejar reposar 10 min. en un lugar oscuro.
13. Observar en microscopio de fluoresencia.










Electroforesis de células individuales (espermatozoides) “Ensayo Cometa”
Solución de lisis 1
(2.5M NaCl, 100mM (0.1M) Na2 EDTA, 10mM (0.010)Tris, 200µg/mL Proteinasa K, 300mM (0.3M) DTT) · (100)
Cantidad de agua destilada (mL)
NaCl (g)
EDTA (g)
Tris-HCl (g)
1000
146.44
37.02
1.20
500
73.2218.51
0.604
250
36.61
9.257
0.302
150
21.96
5.55
0.181
100
14.64
3.70
0.120
50
7.32
1.85
0.060
25
3.36
0.92
0.030
Ajustar pH 10.
Preparación del cöplin
Agregar un volumen de 28 mL (solución de lisis 1 + 5.6 mg/mL de proteinasa K + 1.295 g de DTT). Mantener a 37.5°C.

PROCEDIMIENTO
Preparación de la muestra
[Realizar diluciones en medio mHTF para obtener concentraciones de 5 - 10 million mL-1.]

1.Preparar los portaobjetos con agarosa regular al 0.65%, y secar a 85°C.
2. Preparar el volumen indicado de agarosa de bajo punto de fusión al 1% a 37°C.
3. Pipetear una alicuota de 50µL (20µL de la muestra + 50µL de LMPA) y depositarla en las laminillas pretratadas al 0.65%.
4. Cubrir la muestra depositada con un cubreobjetos.
5. Dejar solidificar a 4°C por 4 min.
6. Retirar cuidadosamente el...