protocolos de laboratorio

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PROTOCOLOS DE
LA B O R AT O R I O

Laboratorio de Genética
Molecular Aplicada
del CIMMYT
Tercera edición

i

El Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMYT®) (www.cimmyt.org) es un
organismo internacional, sin fines de lucro, que se dedica a la investigación científica y la
capacitación relacionadas con el maíz y el trigo en los países en desarrollo. Basadosen la solidez de
nuestra ciencia y en nuestras asociaciones colaborativas, generamos, compartimos y aplicamos
conocimientos y tecnologías con el objeto de incrementar la seguridad alimentaria, mejorar la
productividad y la rentabilidad de los sistemas de producción agrícola, y conservar los recursos
naturales. El CIMMYT recibe fondos para su agenda de investigación de varias fuentes, entreellas,
del Grupo Consultivo para la Investigación Agrícola Internacional (CGIAR) (www.cgiar.org),
gobiernos nacionales, fundaciones, bancos de desarrollo e instituciones públicas y privadas.
© Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMYT) 2004. Derechos reservados.
Las designaciones empleadas en la presentación de los materiales incluidos en esta publicación de
ninguna maneraexpresan la opinión del CIMMYT o de sus patrocinadores respecto al estado legal
de cualquier país, territorio, ciudad o zona, o de las autoridades de éstos, o respecto a la
delimitación de sus fronteras. El CIMMYT autoriza el uso razonable de este material, siempre y
cuando se cite la fuente.
Cita correcta: CIMMYT. 2006. Protocolos de laboratorio: Laboratorio de Genética Molecular
Aplicada delCIMMYT. Tercera edición. México, D.F.: CIMMYT.
ISBN: 968-6923-43-8
Descriptores AGROVOC: inmunoensayos de quimioluminiscencia;
ADN; hibridación del ADN
Otros descriptores: marcadores moleculares; PCR; RAPD; RFLP
Códigos de categorías AGRIS: F30 (fitogenética y mejoramiento)
Clasificación decimal Dewey: 631.523.

ii

Índice
Prólogo

v

Abreviaturas y siglas

vii

Extracción engran escala de ADN

1

Extracción de ADN utilizando un extractor de savia

5

Extracción en pequeña escala de ADN de muy alta calidad

7

Cuantificación y control de la calidad del ADN

11

Marcadores del peso molecular para la electroforesis en gel

13

Electroforesis en gel de agarosa neutral

18

Geles de doble espesor

19

Diagrama de producción de los RFLP

20Digestión del ADN genómico con enzimas de restricción

21

Transferencia de Southern a la membrana MSI

24

Amplificación de insertos de plásmidos con la PCR

26

Amplificación de insertos de cultivos bacterianos con la PCR

27

Incorporación de digoxigenina-dUTP en insertos de plásmidos con la PCR

28

Cuantificación relativa de los insertos amplificados en gel

30Verificación de la actividad de la digoxigenina-dUTP incorporada

32

Hibridación y detección de sondas marcadas con digoxigenina

33

Eliminar la sonda para reutilizar las membranas

37

Protocolos para STS y SSR

38

Fingerprinting del ADN de maíz y de trigo con un secuenciador automático de ADN

48

Protocolo para la quimioluminiscencia de los AFLP

53

Detección de secuenciasde ADN transgénico en el maíz

60

Minipreparaciones de plásmidos

67

Aislamiento de insertos de plásmidos

69

Preparación de células competentes congeladas

70

Preparación de células competentes frescas

71

Transformaciones bacterianas

72

Soluciones concentradas de uso general

73

Programa de cuantificación del ADN con el espectrofotómetro DU-65 de Beckmann

77Hojas de datos

80

iii

Prólogo
El principal motivo de compilar y publicar este manual es proveer a los científicos, investigadores y
estudiantes en los sistemas nacionales de investigación agrícola, las universidades y pequeñas
empresas privadas en los países en desarrollo, así como también a las instituciones de investigación
avanzada en el mundo industrializado, con una guía...