Protocolos diversos

Protocolos Diversos: Especies reactivas de oxígeno
Actividades enzimáticas:
Superóxido dismutasa (EC 1.15.1.1)
Reactivos (SOD assay kit cat. cat.#19160 Fluka):
* Solución de trabajo WST (sustrato): Diluir 1 ml de la solución de WST con 19 ml de solución buffer. La solución es estable a temperatura ambiente
* Solución de trabajo de enzima (Xantina oxidasa): Centrifugar la solución deenzima durante 5 s. Mezclar por pipeteo y diluir 15 μl de esta solución en 2.5 mL de buffer de dilución. Mantener esta solución en hielo.
* Buffer de ensayo 1X: Diluir 1 mL de Buffer de ensayo 5X (500 mM NaH2PO4, 5 mM EDTA, pH 7) en 4 mL de agua.

Procedimiento:
Seguir el siguiente esquema de mezcla en la celda de espectrofotómetro:
| Blanco | SOD |
Extracto | 0 | X |
Buffer deensayo 1X | 60 L | (60-x) L |
Solución de trabajo WST | 400 L | 400 L |

La cantidad adecuada de extracto se debe determinar cada vez que se cambie de tejido. Sin embargo, para células en suspensión de café la actividad de SOD total es lineal en el intervalo de 5 a 40 g, equivalente a una Abs/min de 0.0893 a 0.0272.
La reacción se inicia con la adición de 40 L de solución de trabajo deenzima (XO). Se realiza una cinética enzimática con intervalos de 20 seg durante 4 min, a una longitud de onda de 450 nm. La actividad de SOD se determina utilizando la siguiente curva de calibración:

DAbs/min | Actividad SOD (U) |
0.1004 | 0.0000 |
0.0893 | 0.2421 |
0.0766 | 0.3388 |
0.0670 | 0.4357 |
0.0680 | 0.4841 |
0.0603 | 0.6293 |
0.0592 | 0.7261 |
0.0551 | 0.9682 |0.0405 | y=mx+b
Donde:
y = Actividad SOD (unidades)
x: log (Abs/min)
m = -3.5389
b = -3.5992
1.2103 |
0.0332 | 1.4523 |
0.0272 | 1.9364 |
0.0208 | 2.4205 |
0.0314 | 1.9364 |
Adicionalmente, se puede cuantificar la actividad de Cu/Zn-SOD, utilizando el mismo esquema anteriormente citado, pero incluyendo SDS al 0.15% como inhibidor de las isoforma Mn-SOD. Para esto, 200 L de extractocrudo se mezclan con 30 L de SDS al 2% y 170 L de buffer de ensayo 1X. La mezcla se incuba a 37 ºC durante 30 min. Y se procede de la misma manera que se describió anteriormente. Después de obtener las actividades específicas (en unidades de SOD/mg proteína) en ambos experimentos se procede como se indica a continuación:
* Actividad de la Cu/Zn-SOD = actividad del extracto tratado con SDS* Actividad de la Mn-SOD = (actividad total) – (actividad de Cu/Zn-SOD)

Principio activo del método:
Inhibición de la formación del WST-1 formazan por competencia de la SOD por el sustrato anión superóxido

Glutatión Reductasa (EC 1.6.4.2)
Reactivos:
* Solución de trabajo NADPH (0.16 mg/mL): Diluir 10 L de solución stock de NADPH (40 mg/mL) en 2.5 mL de buffer de ensayo 1X. Lasolución es estable a temperatura ambiente.
* Solución de trabajo de DTNB (0.038 mg/mL): Diluir 228 μl de solución stock de DTNB (1.5 mg/mL) en 8.772 mL de buffer de ensayo 1X. La solución es estable a temperatura ambiente.
* Solución de trabajo GSSG (30 mM). Disolver 0.0919 g de glutatión oxidado en 5 mL de buffer de ensayo 1X. La solución se prepara al momento del ensayo y es estable atemperatura ambiente.
* Buffer de ensayo 1X: Diluir 1 mL de Buffer de ensayo 5X (500 mM NaH2PO4, 5 mM EDTA, pH 7) en 4 mL de agua.

Procedimiento:
Seguir el siguiente esquema de mezcla en la celda de espectrofotómetro:
| Blanco | Glutatión reductasa |
Extracto | 0 | X |
Buffer de ensayo 1X | 25 L | (25-x) L |
Solución de trabajo DTNB | 500 L | 500 L |
Solución de trabajo GSSG |25 L | 25 L |

La cantidad adecuada de extracto se debe determinar cada vez que se cambie de tejido. Sin embargo, para células en suspensión de café la actividad de Glutatión reductasa es lineal en el intervalo de 15 a 45 g, equivalente a una Abs/min de 0.0164 a 0.0407, respectivamente.
La reacción se inicia con la adición de 125 L de solución de trabajo de NADPH. Se realiza una cinética...