PROTOCOLOS

PRÁCTICAS DE FISIOLOGÍA VEGETAL
REDUCCIÓN ASIMILADORA DEL NITRÓGENO: ACTIVIDAD NITRATO REDUCTASA

1. INTRODUCCIÓN
Los procesos biológicos por los que el nitrógeno inorgánico es convertido en nitrógeno orgánico, son la fijación del nitrógeno molecular (N2) y la asimilación de nitrato (NO3-). Sólo ciertos procariotas, en estado libre o en asociación con algunas plantas, son capaces de fijar yasimilar el nitrógeno molecular presente en la atmósfera.
El NO3- del suelo es la fuente principal de N para muchas plantas en donde, en gran parte, experimenta un proceso de reducción asimiladora de NH4+, que está ligada fundamentalmente al proceso fotosintético. Esta reducción del NO3- tiene altos costes energéticos para la planta, pues requiere de 8 é, en dos pasos enzimáticos sucesivoscatalizados por la nitrato reductasa y la nitrito reductasa. El poder reductor puede ser suministrado por las reacciónes lumínicas de la fotosíntesis o por la glucolisis y respiración.


NADH NAD 6 Fd red 6 Fd ox
NO3- NO2- NH4+,
Nitrato Nitrito
reductasa reductasa


El nitrato que esabsorbido por la raíz puede ser reducido y asimilado en la propia raíz o ser transportado a la parte aérea de la planta, en donde es asimilado. Las proporciones que se asimilan en la raíz o en las hojas dependen tanto de factores externos como de factores intrínsecos de la planta. El efecto de la adición de NO3- en las plantas produce en las mismas un notable incremento de la actividad nitratoreductasa. Ésta es una enzima inducible por NO3-, aunque en algunas especies se observan unos bajos niveles constitutivos. Tras la adición de NO3- se produce un rápido aumento de la cantidad de mRNA de la nitrato reductasa como resultado de la activación de la transcripción del gen. Además, el NO3- también ejerce un control positivo postranscripcional incrementando la estabilidad de los mRNA y de lasproteínas enzimáticas sintetizadas “de novo”. Aunque el NO3- es el inductor primario de la expresión de la nitrato reductasa, la luz incrementa la transcripción del gen y el nivel de proteína que codifica. Este efecto estimulador de la luz está mediado por el fitocromo.

2. OBJETIVOS
a) Realizar el ensayo “in vivo” de la actividad nitrato reductasa
b) Relacionar la reducción del nitrato condisponibilidad de sustrato

3 MATERIAL
-Hojas frescas de acelga o de espinaca
-Medio de incubación: tampón fostato potásico 0.1 M pH 7.5, EDTA 1 mM, n-propanol 1% (v/v) y Triton X-100 0.01% (v/v)
-Reactivo de sulfanilamida al 1%: 1 g del reactivo se disuelve en 20 ml de ClH y se diluyen hasta 100 ml con agua destilada
-Reactivo de N-1-naftil-etilenddiamiona diclorhidrato (NNEDA) al 0.02%(p/v) en agua destilada
-Solución de nitrito potásico (100 nmoles/ml)
-Pizeta con agua destilada
-Gradilla con 4 tubos de ensayo de 25 x 150 mm, 4 tubos de ensayo de 15 x 150 mm y 5 tubos de ensayo cortos
-Varilla de vídrio
-Pinzas metálicas
-Vaso de precipitado de 1 l
-Vaso de precipitado de 250 ml
-3 pipetas graduadas de 5 ml y 2 pipetas de 1 ml
-Cubetas o tubos de vídrio paraespectrofotómetro
-Baño termostatizado a 30ºC
-Espectrofotómetro

4. METODOLOGÍA
Se dispondrá de 2 tubos de ensayo de 25 x 150 mm con 5 ml de medio de incubación sin nitrato y de 2 tubos con 5 ml de medio de incubación con nitrato.
En cada uno de los 4 tubos se introducen 1 g de hoja de acelga (o 0.5 g de hoja de espinaca) troceada fina y homogéneamente. Se ponen a incubar en baño termostatizado a30ºC durante 50 min. Pasado este tiempo, para parar la reacción enzimática y falicitar la salida del nitrito formado en el tejido, se ponen al baño maría hirviendo durante 5 min. Se agita vigorosamente y se deja enfriar.
Valoración de los nitritos: Se toman alícuotas de 1 ml del medio de incubación, se les añade 1 ml del reactivo de sulfanilamida y 1 ml de reactivo de NNEDA. Esta mezcla se...