Prueba de elisa

ENSAYOS INMUNOENZIMÁTICOS
Práctica 7
1. Introducción
La técnica ELISA (ensayos de inmunoabsorbencia ligada a enzimas) se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción marcada enzimáticamente cuyo producto, puede ser medido espectrofotométricamente. La cantidad de antígeno se determinacomparando la curva estándar generada con cantidades conocidas del antígeno.
Ventajas: versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos económicos y consigue, mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre, es fácil de adaptar a analizadores automáticos. Este se caracteriza por ser un método cuantitativamente exacto por lamedición de la velocidad de la reacción y la duración de la reacción en un instante fijo único
Desventajas: para adaptarlo a analizadores automáticos se necesitan de reactivos muy purificas, lo que aumenta el costo de las pruebas.

2. Objetivos
* Conozca los principios en los que se basa la prueba de ELISA
* Se familiarice con el equipo utilizado para la elaboración del la prueba deELISA.
* Conozca la importancia de este tipo de pruebas y su aplicación en el ámbito de la medicina.

3. Antecedentes
Dispositivos Empleados En ELISA
Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal de los orígenes a las actuales microplacas de 96 pocillos de plástico tratado para aumentar su capacidad de absorción de moléculas y con fondos de pocillo ópticamente clarospara poder realizar las medidas de densidad óptica en instrumentos específicos, espectrofotómetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA. Actualmente se están desarrollando dispositivos de mayor capacidad, por ejemplo con 384 y 1536 pocillos, adecuados para los sistemas de “screening” masivo de los sistemas robotizados (HTS, High throughput system).
Los lectores ELISAson espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotómetro convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que sólo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda. Son la que secorresponden con las necesarias para determinar la densidad óptica de los cromógenos más comúnmente utilizados.

Fases de un ensayo ELISA
Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:
1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina). El anticuerpo conjugado al enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc.. El antígeno marcadose emplea en ensayos de competición de antígeno.

2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.

3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpoanti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentesrelaciones de antígeno frio frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno.

4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría....