Pruebas Bioquimicas

2.2.2.- PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Agar Hierro Tres Azúcares (TSI) y Agar Kligler
I. Principio
El medio fue diseñado para determinar la habilidad de las bacterias de fermentar hidratos de
carbono y producir sulfuro de hidrógeno (SH2). El medio contiene 1 parte (0.1%) de glucosa y
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10 partes (1.0%) de lactosa y sacarosa. El indicador de pH es el rojo fenol y el sulfato ferroso
pone en evidenciala formación de SH2. Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la
punción como la estría aparecerán de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y/o
sacarosa, la estría permanecerá ácida (amarilla). Si no fermenta lactosa, la estría se vuelve
alcalina (roja). Los organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del
medio o producirán productos alcalinos y el medio TSIpermanecerá rojo. La producción de
SH2 se manifiesta por un ennegrecimiento del medio.
El agar de Kligler contiene dos azúcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%). Este medio puede
reemplazar al TSI, la diferencia entre ambos es la ausencia de sacarosa. Los fundamentos
bioquímicos y la interpretación de los resultados son los mismos para ambos medios.
II. Materiales
El medio está disponiblecomercialmente. Disolver en agua destilada y dispensar volúmenes
de 5.0 ml en tubos con tapa a rosca; autoclavar a 121º C por 15 minutos y enfriar inclinado
dejando un fondo de 5 a 10 mm. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular indicando fecha
de preparación y de expiración.
Guardar en heladera; si hay cambio de color no usar.
III. Procedimiento
A. Con un ansa estéril tomar material.
B.Punzar el fondo en el centro.
C. Retirar el ansa y estriar sobre la superficie del agar.
D. Dejar la tapa floja para permitir intercambio de aire.
E. Incubar a 37º C por 18 a 24 horas.
IV. Resultados
A. Estría ácida/fondo ácido (amarillo/amarillo): fermentación de glucosa, sacarosa y/o
lactosa (E. coli).
B. Estría alcalina/fondo ácido (rojo/amarillo): fermentación de glucosa solamente(Shigella spp.).
C. Estría alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa).
D. Precipitado negro en el fondo: producción de SH2 (Salmonella spp).
E. Burbujas o roturas: producción de gas (E. coli, Salmonella spp.).
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V. Control de Calidad
Bacteria Estría Punción SH2
Salmonella Typhi K A + (*)
Salmonella Paratyphi A K Ac/g -
Salmonella spp. K A +
Shigella spp. K A-
Enterobacter aerogenes A Ac/g -
Enterobacter cloacae A Ac/g -
Escherichia coli A Ac/g -
Citrobacter A Ac/g +
Klebsiella A Ac/g -
Proteus vulgaris A A oAc/g +(sucio)
Proteus mirabilis K Ac/g o A + (sucio)
Klebsiella pneumoniae A Ac/g o A -
(*) sólo en la parte superior de la punción o formación de un anillo.
A:ácido; K:alcalino; c/g: cn gas
VI. Consideraciones
A. Cuando se agrupan losmiembros de la familia Enterobacteriaceae, las reacciones del
TSI y KIA pueden variar ligeramente. Algunos no fermentadores de lactosa pueden fermentar
sacarosa.
B. El test se debe leer entre las 18 y 24 horas. Lecturas tempranas pueden dar falsos
resultados ácido/ácido, mientras que lecturas tardías pueden dar falsos resultados
alcalino/alcalino.
C. Una gran producción de SH2 enmascara lareacción de la glucosa. Sin embargo la
glucosa fue fermentada aunque no se vea el cambio de color. Observar si hay producción de
gas.
D. En el TSI, la utilización de sacarosa puede suprimir el mecanismo enzimático que
resulta en la producción de SH2. Por esta razón, algunos organismos pueden demostrar
producción de SH2 en KIA pero no en TSI.
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Agar Lisina Hierro (LIA)
I. Principio
Ladecarboxilación de la lisina a cadaverina produce una alcalinización del medio y un viraje
al violeta del indicador púrpura de bromocresol. Como la reacción tiene lugar en medio ácido,
es necesaria la fermentación previa de la glucosa.
Los microorganismos que no decarboxilan lisina, pero fermentan la glucosa producen un
viraje al amarillo en todo el medio.
La formación de SH2 produce una...