PRUEBAS BIOQUiMICAS

Guia 6
PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA IDENTIFICACION DE BACTERIAS


1. Introducción

La correcta detección e identificación de los microorganismos presentes en muestras clínicas o de otros orígenes es imprescindible para determinar el origen de las infecciones, seguir el curso de una enfermedad o contaminación ambiental, etc y decidir los tratamientos a aplicar.
La identificación de bacterias puedebasarse en muchos caracteres: morfológicos, fisiológicos, bioquímicos, serológicos y moleculares.

Las pruebas bioquímicas permiten determinar parámetros metabólicos propios de diversos géneros y especies bacterianas. Por medio de la utilización de medios selectivos, diferenciales, indicadores de pH y diversos reactivos, es posible determinar la presencia de enzimas, la utilización de diversoscarbohidratos y las vías por las cuales los utilizan (oxidativa o fermentativa), la producción de H2S, etc. Para lograr los resultados correctos, debe utilizarse cultivos puros y en fase exponencial de crecimiento.

La identificación bioquímica se realiza utilizando baterías de tubos, donde se inoculan las cepas en diversos medios de cultivo, también existen baterías comerciales que vienen con losmedios deshidratados y sólo se inocula la cepa en estudio, por ejemplo sistema API 20 E para Enterobacterias que permite determinar 20 pruebas a la vez. Los sistemas más modernos son automatizados, como el BIOLOG, que permite la identificación de bacterias en base a su capacidad de para metabolizar 95 fuentes de carbono diferentes

2. Pruebas Bioquímicas:
a) Prueba de la catalasa: se basa endeterminar la presencia de la enzima catalasa, que descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. Esta enzima está presente en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que presentan citocromo c. Por ejemplo E coli, catalasa positivo, Enterococcus faecalis, catalasa negativo
Procedimiento:
- Con el asa de siembra tomar una colonia pura de 18-24 horas de incubación y colocarsobre un portaobjetos limpio.
- Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre la colonia
Resultados:
- Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).





b) Prueba con Agar Hierro Kliger: permite determinar la capacidad de un microorganismo de utilizar un hidrato de carbono específico incorporado a un medio de crecimiento básico con producción con producciónde ácidos . También permite detectar la producción de gas y/o de SH2 . El medio contiene lactosa al 1% y glucosa al 0,1%, peptonas, citrato férrico, tiosulfato de sodio y rojo fenol como indicador de pH. La detección de ácidos se detecta por el viraje del indicador, de rojo a amarillo (acidez)
Para distinguir entre la producción de ácidos a partir de ambos azúcares, el medio tiene lactosa 10veces mas concentrada que la glucosa, por lo que la bacteria no la puede agotar, además el medio está inclinado en pico de flauta , lo que permite que la siembra se realice en picadura (parte recta del tubo) y en estría (en pico de flauta).
La producción de SH2 se genera a partir del tiosulfato de sodio cuando se combina con el citrato férrico, originando súlfuro de fierro, que se observa como unprecipitado negro. Finalmente, lo gases se visualizan por la fractura o desplazamiento del agar en el tubo.

Procedimiento:

Inocular el tubo con una asa recta, haciendo una picadura hasta el fondo del tubo y a continuación una siembra en estrías en la superficie del pico de flauta.
Incubar a 37ºC durante 24 hrs.
Realizar la lectura observando el viraje del indicador (amarillo: acidez; fucsia:alcalinidad); precipitado negro (producción de SH2 y fractura o desplazamiento del agar (producción de gas)

Resultados:


Medio de cultivo sin inocular











c) IMVIC: corresponde a 4 pruebas que se utilizan para la identificación de Enterobacterias.
Producción de Indol (I): permite determinar si la bacteria produce la enzima triptofanasa que hidroliza el triptofano produciendo indol, acido...