Pruebas Inmunologicas ELISA

Instituto Politécnico Nacional
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

Biotecnología de la Respuesta Inmune
5BV1
Profesor:
Cesar Agustín Jiménez Sierra

Espinosa Pacheco Camilo
Morales Martínez Francisco Javier
Pérez Mora Wendy Aracely.
Velo Silvestre Jazmín Elizabeth

Pruebas
Inmunológicas
ENZIMOINMUNOANÁLISIS
(ELISA de “Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay”)

PruebasInmunológicas
La serología es la rama de la inmunología que
estudia las interacciones antígeno-anticuerpo
para su aplicación en el diagnostico clínico.
Hay seis tipos fundamentales de pruebas
serológicas:
1. Reacción de precipitación
2. Aglutinación
3. Fijación del complemento
4. Inmunofluorescencia
5. Radioinmunoensayo
6. Enzimoinmunoanálisis (ELISA).

ENZIMOINMUNOANÁLISIS (Prueba
De ELISA)
Fue descrito en1971 por los investigadores
suecos Eva Engvall y Peter Perlman, y en
la actualidad se designan con este nombre
a todos los inmunoensayos enzimáticos
en fase heterogénea.

Este ensayo se basa en el
uso
de
antígenos
o
anticuerpos marcados con
una enzima, de forma que
los conjugados resultantes
tengan
actividad
tanto
inmunológica
como
enzimática pudiendo ser
revelada
mediante
la
adición de unsubstrato
específico
que,
en
contacto con la enzima,
producirá
un
color
observable a simple vista y
cuantificable por un lector
de densidad óptica.

Componentes de una prueba ELISA
• Muestra
• Fase sólida o soporte: Posos o placas en donde se
realizan las pruebas estos pueden ser de
diferentes materiales; nitrocelulosa, polivinilo,
poliestireno, látex, nylon, celulosa y sefarosa.
• Antígeno o Anticuerpo(policlonales o
monoclonales)
-Anticuerpos policlonales:
heterogéneos
Reconocen epítopos diferentes del Ag
Producidos por numerosos clones de Linfocitos B
-Anticuerpos Monoclonales:
Homogéneos
Especificidad única
Producidos por un único clon de Linfocitos B

• Conjugado-Enzima: Algunas de las características de deben
reunir son:
♦ Actividad especifica
♦ Pureza
♦ Estabilidad
♦ Solubilidad
♦ Fácilmedición y detección
♦ No se reduce la actividad por la conjugación
♦ Bajo costo
♦ Estables en amplio intervalo de condiciones del ensayo.
♦ Con grupos funcionales adecuados para su unión a
Anticuerpos o Antígenos.
Algunas de las enzimas que se utilizan son:
Peroxidasa
Fosfatasa alcalina
β-galactosidasa
Penicilinasa
Ureasa
Glucosa oxidasa

• Bloqueo: Proteína ajena al sistema que se estamanejando el cual recubre los espacios huecos que
no llena el Antígeno; Estos se utilizan para que los
Anticuerpos no se unan de forma inespecífica a la
fase solida.
Caseína
Caseína/Tween20
Tween 20
Gelatina
BSA
• Sustrato:
Solubles en agua
Fácil de manipular
No tóxicos
No mutágenicos
Bajo costo

La técnica de ELISA se caracteriza por presentar
alta sensibilidad, especificidad, rapidez y
economía.Brinda la posibilidad de analizar un
gran número de muestras de manera sencilla ,
rápida y económica, sin mayor infraestructura.
Existen diferentes modalidades de ELISA y el
método
competitivo,
que
permiten
la
determinación de antígenos o anticuerpos en
fluidos biológicos.






Directo. Inmunohistoquímica
Indirecto
Sándwich
Competitivo
Inhibición

Directo
Se utiliza específicamente paradetectar un antígeno,
porque busca a una sustancia extraña.
En una prueba de ELISA directa la cual es considerada
la más simple, el antígeno se adsorbe en una placa
de plástico, a continuación un exceso de otra
proteína (generalmente albúmina de suero bovino)
se añade para bloquear todos los otros sitios de
unión. Mientras que una enzima está ligada a un
anticuerpo en una reacción separada, el complejoenzima-anticuerpo se aplica para adsorber al
antígeno.
Posteriormente el exceso de complejo enzimaanticuerpo se lava, quedando enzima anticuerpo
unido
a
antígeno.
Mediante la adición del sustrato de la enzima se
detecta la enzima que ilustra la señal del antígeno.

S i s t e m a s

d e

E l i s a

Método Directo de ELISA

Antígeno*

Bloqueador

100 μl

Conjugado
Ab-E

Sustrato
enzimático

*...