Pruebas

ANATOMÍA PATOLÓGICA
HOSPITAL HIGUERAS

PROTOCOLO GENERAL PARA TÉCNICA INMUNOHISTOQUÍMICA

Tipo de muestra: Tejido fijado en formalina buffer e incluido en parafina.
Corte: 4 u en portaobjeto silanizado.

PROCEDIMIENTO:

1) Marcar láminas con cada anticuerpo a determinar
2) Desparafinar e hidratar las láminas en:

|REACTIVO |TIEMPO|
|XILOL I |5 MINUTOS |
|XILOL II |5 MINUTOS |
|ALCOHOL ABSOLUTO I |5 MINUTOS |
|ALCOHOL ABSOLUTO II |5 MINUTOS |
|ALCOHOL DE 95% I |5 MINUTOS |
|ALCOHOL DE 95% II |5MINUTOS |
|ALCOHOL DE 70% |5 MINUTOS |
|TIEMPO TOTAL |35 MINUTOS |

3) Colocar en agua corriente por 5 minutos.
4) Pasar rápidamente por agua destilada
5) Hacer bloqueo de peroxidada endógena con Peróxido de hidrógeno de 10 vol. por 5 minutos.
6) Lavar con agua corriente por 2 minutos.7) Pasar rápidamente por agua destilada.
8) Realizar recuperación antigénica (según lista de anticuerpos ver recuperador estandarizado).
9) El protocolo de recuperación se adjunta al final del protocolo general.
10) Pasar rápidamente las láminas por agua destilada.
11) Antes del siguiente paso se debe marcar en cada lámina un cuadrado alrededor del tejido, con un lápiz hidrofóbico,para evitar que se escurran los líquidos que se agregarán luego.
12) Colocar a cada lámina solución bloqueadora de proteínas Ultra V Block, por 5 minutos, a temperatura ambiente (agregar 100 ul por tejido).
13) Retirar la solución bloqueadora a cada lámina, con bomba de aspiración y agragar inmediatamente el anticuerpo primario (195 ul por tejido).
14) Colocar la cámara de incubación, conlas láminas, en la estufa a 37ºC por 30 minutos.
15) Retirar el anticuerpo primario, con bomba de aspiración, agregando inmediatamente (no debe secarse el tejido) el buffer de lavado, dejar 2 minutos.
16) Lavar nuevamente con buffer de lavado por 2 minutos.
17) Retirar el buffer de lavado, con bomba de aspiración y colocar el anticuerpo secundario Primary Antibody Enchancer 100 ul portejido. No deber secarse el tejido.
18) Colocar la bandeja de incubación en la estufa a 37ºC por 10 minutos.
19) Retirar el anticuerpo secundario, con bomba de aspiración, agregando inmediatamente (no debe secarse el tejido) el buffer de lavado por 2 minutos.
20) Lavar nuevamente con buffer de lavado por 2 minutos.
21) Retirar el buffer de lavado, con bomba de aspiración y colocar elHRP polymer, 100 ul por tejido. No debe secarse el tejido.
22) Colocar la bandeja de incubación en la estufa a 37ºC por 15 minutos
23) Retirar el HRP Polymer, con bomba de aspiración, agregando inmediatamente (no debe secarse el tejido) el buffer de lavado, dejar 2 minutos.
24) Lavar nuevamente con buffer de lavado por 2 minutos.
25) Retirar el buffer de lavado, con bomba deaspiración, agregando inmediatamente (no debe secarse el tejido) el cromógeno (DAB) dejar 3-5 minutos en oscuridad, controlar al microscopio.
26) Escurrir el DAB lavando cada lámina con una piceta con agua destilada, en contenedor que contenga agua con cloro (para inactivar).
27) Colocar luego la lámina en copling con agua destilada.
28) Lavar dos veces las láminas dentro del copling, con aguacorriente.
29) Realizar contraste nuclear, con hematoxilina de Harris por 20 segundos.
30) Lavar en agua corriente por 3 minutos.
31) Azular las láminas con carbonato de litio a saturación por 10 segundos.
32) Lavar con agua corriente por 5 minutos.
33) Deshidratar, aclarar las láminas según la tabla:
|REACTIVO |TIEMPO |
|ALCOHOL DE 70%...