Práctica de Biología Molecular

PRÁCTICA DE BIOLOGÍA MOLECULAR 2014
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INTRODUCCIÓN
El ADN es el material genético que da a los seres vivos sus características genotípicas y fenotípicas. La estructura básica del ADN es idéntica en todos los organismos y está compuesta por dos cadenas de nucleótidos unidas por la complementariedad de las bases a través de puentes de hidrogeno entre A y T o C y G enforma de doble hélice. Cada nucleótido consiste de una molécula de azúcar (desoxiribosa), un grupo fosfato y una de las cuatro bases nitrogenadas: adenina, citosina, guanina o timina. El ADN está localizado dentro del núcleo de las células eucariotas, rodeado de proteínas llamadas histonas y está organizado en cromosomas. El aislamiento y purificación de ADN, es el primer paso en cualquier análisisgenético. La selección del método de extracción está determinada por la estructura celular de cada organismo y la aplicación que se requiere. En general dada su complejidad macromolecular, los ácidos nucleícos son difíciles de separar de los componentes de membrana (lípido, proteína, carbohidratos) y de otras moléculas solubles (polisacáridos). Existen métodos que alteran la estructura ycaracterística del ADN, de ahí que se elaboren métodos capaces de eliminar impurezas de las preparaciones basándose en las propiedades físico-químicas de los ácido nucleícos. La mayoría se caracterizan por el empleo de detergentes y solventes orgánicos que rompen los núcleos de las células y remueven las proteínas adheridas al ADN, seguidos por la precipitación de éste con sales y alcoholes. El método parala extracción de ADN por precipitación con sales (Método de Miller) consiste en la obtención de leucocitos a partir de sangre periférica y se basa en la precipitación de proteínas celulares, con una solución saturada de cloruro de sodio. Para estimar la cantidad de ADN genómico y verificar su pureza se determina la densidad óptica a 260 nm y 280 nm por medio de un espectrofotómetro. Una relaciónde densidad óptica 260/280 nm entre 1.8 y 2.0 indica que el ADN tiene una pureza adecuada; mientras que si es menor, se debe considerar contaminación de la muestra, principalmente por sales o proteínas. Durante los 80”s, Kary Mullis desarrolló una metodología capaz de generar millones de copias de una secuencia de ADN especifico. Esta técnica conocida como Reacción en Cadena de la Polimerasa(Polimerase chain reaction: PCR) es un proceso bioquímico in vitro mediante el cual las cadenas individuales de ADN blanco son duplicadas por la enzima ADN polimerasa a partir de las moléculas de ADN de cadena sencilla denominados primers o indicadores, los cuales se utilizan en cada uno de los ciclos (generalmente entre 20-30) que integran la reacción. Al final de ciclo las cadenas nuevas vuelven a serduplicadas por las mismas enzimas, lográndose una producción exponencial de millones de copias del gen o segmento de ADN específico sometido al proceso.

En la siguiente parte se describe brevemente el material y los reactivos que se utilizan en la extracción de ácidos nucleícos, analiza y compara con los que observes en la práctica del laboratorio estatal.

A. EQUIPOS Y REACTIVOS
•Centrífuga refrigerada, minicentrífuga, vortex, placa calentadora
• Micropipetas
• Tubos de PCR de 1.5µl
• Solución B
• Proteinasa K
• SDS 10%
• NaCl 6M
• Etanol o alcohol absoluto

B. PROCEDIMIENTO

Extracción de ADN genómico.
• El botón de leucocitos extraído en la práctica anterior se descongela a temperatura de 37 grados centígrados para posteriormente resuspenderlo en 3 ml debuffer de lisis de núcleos llamada solución B (Tris HCl 10mM, NaCl 400 mM, EDTA Na2 2mM, pH 8.2).
• El lisado de leucocitos se deja en digestión toda la noche a 37̊C con 0.2 ml de SDS al 10%, 0.5 ml de solución de proteinasa K (1 mg de proteinasa K en SDS al 10% y EDTA Na2 2mM pH 8.2).
• Al siguiente día adicionar 1 ml de solución saturada de NaCl 6M
• Agitar vigorosamente por 15 seg.
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