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TEMA 9- SISTEMAS DE MODIFICACIÓN CELULAR

Esta clase corresponde al tema 9 de la asignatura de Cultivos Celulares de 3r curso de la licenciatura de Biotecnología.
En los temas previos, el alumno ha adquirido los conocimientos básicos sobre el mantenimiento de las células animales en cultivo, tanto de las líneas celulares como de los cultivos primarios (temas 7 y 8 del programa). En elpresente tema se introducen las técnicas disponibles para la introducción de macromoléculas en las células en cultivo. Inicialmente se expondrán diversas aplicaciones de estas técnicas, para proporcionar al alumno las motivaciones que conducen al desarrollo de estas estrategias. También se dará a conocer al alumno los genes marcadores como herramienta muy importante para la medida de la tasa detransfección o transducción. Después, se explicarán los distintos métodos de transfección de ADN, tanto químicos como físicos. Se compararán los distintos métodos y se pondrá énfasis en la importancia que tiene la puesta a punto del método de transfección para cada tipo celular. Por último se presentará el método que se utiliza para la obtención de células estables y se comparará con la transfeccióntransitoria, para que los alumnos puedan valorar las ventajas e inconvenientes de cada método. En la siguiente clase se tratará la introducción de ADN exógeno mediante la infección con virus, y se verán las vectores virales más utilizados en la actualidad: adenovirus, retrovirus y lentivirus.

Diapositiva 1- Esquema de los contenidos del Tema 9 donde se remarcan los puntos que se van tratar en estaclase.

Diapositiva 2-Manipulación del cultivo celular para la modificación de la expresión y/o función de los genes.
Para modificar la expresión de los genes o la función de las proteínas de una célula podemos introducir distintas moléculas según nuestro interés.
Ácidos nucleicos los cuales pueden codificar por un gen de interés que queremos que se exprese (ADN o ARNm) o bién moléculas queactuarán como reguladoras de la expresión de los genes de la célula (RNAi o antisense)
Proteínas: con el fin de evaluar su función en el entorno celular o proteínas que sean capaces de bloquear la función de una proteína endógena (dominantes negativos). Normalmente son la misma proteína con una mutación que la inactiva.
Anticuerpos: la introducción de anticuerpos normalmente se hace con el fin debloquear la función de la proteína a la cual se unen específicamente.

Diapositiva 3- ¿Con qué finalidad queremos introducir ADN en una célula?
Pueden existir motivos muy diversos, pero a modo de ejemplo aquí se proponen varias razones:
Conferir a la célula ventajas selectivas, es decir que pueda sobrevivir en unas condiciones que las otras células no superarán, por ejemplo crecer en presenciade una sustancia tóxica.
También puede interesar caracterizar la función que tiene la proteína para la que codifica el ADN que hemos introducido.
Podría ser interesante introducir una proteína marcada con una señal que nosotros podremos detectar, para poder conocer dónde se encuentra dentro de la célula (citoplasma, núcleo, mitocondrias, membrana…)
Podríamos querer estudiar la región promotorade un gen, para saber como se regula su expresión
O también podemos querer utilizar las células como fábricas para la producción de un proteína con interés farmacológico.

Diapositiva 4- Condiciones ideales.
Nosotros querríamos obtener una eficiencia de transfección del 100%, por lo tanto que todas las células expresen el transgen, y que además todas sobrevivan a la modificación, por lo tantotoxicidad nula.
Estos resultados son muy difíciles de obtener, y normalmente nos conformamos con elegir la condición permita obtener una eficiencia suficiente sin causar mucha muerte celular.
De hecho se tiene que establecer el método y las condiciones óptimos para cada tipo celular empíricamente.

Diapositiva 5- En el caso de introducción de ADN en las células se utilizan dos tipos de...