PuAislamiento y Purificación de la Proteínas de la Leche α- Lactoalbumina




Aislamiento y Purificación de la Proteínas de la Leche α- Lactoalbumina




Cristóbal Dünner

I- Introducción
La preparación pura de una proteína es esencial antes de determinar sus propiedades, estructura y composición, por lo que es necesario aislarla y purificarla. Los métodos deseparación de proteínas aprovechan propiedades tales como la carga, tamaño y solubilidad, que varía entre una y otra proteína (1). Las proteínas globulares son solubles porque sus residuos de aminoácidos polares, ácidos y básicos establecen interacciones con el agua. Cualquier agente que interrumpa estas interacciones proteína-agua disminuirá la solubilidad de la proteína, la que entonces precipitará. Unode los agentes precipitantes más utilizados son las sales inorgánica específicamente el sulfato de amonio, que en solución se encuentra altamente solvatado, reduciendo el agua disponible para interactuar con la proteína en solución. Para cada proteína existe una concentración de sal sobre la cual la proteína no podrá permanecer en solución y precipitará (salting out) (2). Además las proteínasglobulares son relativamente más solubles en agua y en soluciones de baja fuerza iónica, aunque algunas coagulan cuando se calientan.
Por otro lado, la composición de aminoácidos es también responsable del comportamiento de las proteínas en diferentes condiciones de pH. Así, al acidificar o alcalinizar una proteína determinada, ésta puede llegar a su punto isoeléctrico, alcanzar una carga neta decero y, por lo tanto, precipitar (3). En el caso particular de la α-Lactoalbúmina, el punto isoeléctrico es a pH 3. De manera que se utilizaran ambos métodos mencionados para aislar y purificar la α-Lactoalbúmina.

Objetivos
- Aislar y purificar la proteína α-Lactoalbúmina presente en la leche.
- Cuantificar esta proteína mediante el método de Bradford





II- Experimental
II.1-Losmateriales y reactivos utilizados se indican en la tabla N°1
Materiales
Reactivos
Tubos Eppendorf 1.5 mL
Leche descremada
Micropipetas 20, 200, 1000 L
(NH4)2SO4 anhidro (Winkler)

Puntas plásticas 200, 1000 L
HCl concentrado


HCl 1N
Espátula y botes para pesar
NaOH 1N

Barras magnéticas
NH4HCO3 0.05M(Winkler)

Embudo de vidrio , pipetas Pasteur y vaso de precipitado 50,100 y250 ml
BSA

Papel filtro y de pH
Reactivo de Bradford (Winkler)
Baqueta de vidrio
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Tubos Falcón 15 y 50 mL
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Cubetas plásticas y Pipetas
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Tabla N°1. Se muestra la lista de Materiales y reactivos utilizados.



II.2- Equipos Utilizados:
En este trabajo práctico se utilizaron los siguientes equipos:
-Balanza Granataria-ADAM (CQT601) -CentrifugaTecnigen (Rotofix 32 A)
-Agitador magnético (Biomega)

II.3-Diagrama de flujo procedimiento experimental
En el siguiente esquema se presenta de manera sistemática el procedimiento realizado en el laboratorio:




III-Datos y Cálculos

III.1-Se preparó una disolución de NH4HCO3 0,05 M con agua, para obtener un volumen final de 100 ml. El peso molecular deNH4HCO3 es de 79 gr/mol.
El cálculo realizado se indica a continuación:
M=moles/l = gr/mol/l (Ecuación 1)
Por lo tanto
0,05= gr/79 en 1L
gr =3,95 en 1L pero se requiere preparar 100 ml por lo tanto seria 0,395 gr.
Para la medición en el espectrofotómetro se prepararon las muestras en las cubetas agregando: Muestra + agua hasta un volumen de 800 µl. El volumen del Reactivo de Bradford esestándar (200µl). Esto se ejemplifica a continuación
-Muestra 1 se tomaron 10 µl +790µl de agua + 200 µl de Reactivo de Bradford
-Volumen de agua= 800 µL- 10 µL= 790 µL de agua destilada.
-Muestra 3 se tomaron 20 µl +780µl de agua + 200 µl de Reactivo de Bradford
III.2 Valor del Blanco
Absorbancia total - Absorbancia Blanco = Absorbancia Proteínas
Se prepara el blanco:
Blanco = 800 µl H2 O +...