PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA BADH DE P. aeruginosa POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Y ENSAYO DE SU ACTIVIDAD

INTRODUCCIÓN

La purificación de las enzimas requiere técnicas y tratamientos bioquímicos y suele realizarse en varios pasos combinando la centrifugación y ultracentrífuga, la precipitación de las proteínas con sales o calor, la separación en columna mediante cromatografías de exclusión molecular, de intercambio iónico o de afinidad, o la separación en geles de electroforesis. Lo ideal es poderpurificar la enzima con un alto rendimiento empleando el menor número de pasos posibles.( Castillo,2005)
La Betaína Aldehído Deshidrogenasa (BADH) pertenece a la familia de las aldehído deshidrogenasas, enzimas que catalizan la oxidación irreversible, de los aldehídos a sus correspondientes ácidos carboxílicos, con la concomitante reducción del NAD+ o de NADP+. El NAD+ es la coenzima preferidaen la mayor parte de ellas, incluidas las enzimas de plantas y de animales, pero unas pocas bacterianas usan indistintamente NAD+ y NADP+, siendo un ejemplo de estas P. aeruginosa.(Muñoz, 2004)
En el patógeno oportunista P. aeruginosa esta enzima juega el triple papel de participar en el catabolismo de colina, o los precursores de colina, producir el osmoprotector glicina betaína que le permite ala bacteria contender con las condiciones hiper-osmóticas de los tejidos que infecta y suministrar NADPH, necesario para el anabolismo y para la respuesta de la bacteria al estrés oxidativo que las defensas del hospedero le imponen.( Muñoz,2004)
El principal uso de la cromatografía de afinidad hasta el momento ha sido la purificación de proteínas, membranas y polisacáridos. La cromatografía deintercambio iónico es un método que permite la separación de moléculas basada en sus propiedades de carga eléctrica. Se compone de dos fases: la fase estacionaria o intercambiador iónico, y la fase móvil. La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie cargas electrostáticas fijas, que retienen contraiones móviles que pueden intercambiarse por iones de la fase móvil, la cual suele ser unadisolución acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgánico miscible con agua que contiene especies iónicas generalmente en forma de buffer. Los iones de ésta compiten con los analitos por los sitios activos de la fase estacionaria (Lehninger, 2005).
El principio básico de la cromatografía de intercambio iónico es que las moléculas cargadas se adhieren a los intercambiadores deforma reversible de modo que dichas moléculas pueden ser asociadas o disociadas cambiando el ambiente iónico. La separación mediante intercambiadores iónicos se realiza por lo general, en dos fases: en la primera las sustancias a separar se unen al intercambiador utilizando condiciones que originan una unión fuerte y estable; a continuación, se eluye de la columna con buffers de diferentes pH odiferente fuerza iónica, compitiendo los componentes del buffer con el material por los sitios de unión (Lehninger, 2005).
Un intercambiador iónico es, por lo general, un polímero que tiene grupos cargados unidos. La mayoría de las proteínas son estables dentro de un margen de pH determinado, es decir, hay un margen en el que no se desnaturalizan, en el que están cargadas positiva o negativamente.Por lo tanto si una proteína es estable a valores de pH por encima del punto isoeléctrico, se debe utilizar un intercambiador anicónico. Si es estable a valores de pH situados por debajo del punto isoeléctrico, debe utilizarse un intercambiador catiónico (Voet, 2006).
La electroforesis es una técnica de separación de moléculas en una mezcla por aplicación de un campo eléctrico. Las moléculasdisueltas se desplazan o migran en un campo eléctrico a una velocidad determinada por su relación carga: masa. La separación electroforética de proteínas se suele efectuar en geles de poliacrilamida. Cuando una mezcla de proteínas se aplica en un gel y se le pasa a una corriente eléctrica, las proteínas más pequeñas migran más rápido a través del gel que las proteínas más grandes. Los geles se...