Purificación de proteínas y electroforesis en geles SDS-PAGE.

TRABAJO PRÁCTICO N°5:
Purificación de proteínas y electroforesis en geles SDS-PAGE.
























- 2014 –
Introducción

Para el estudio de proteínas como por ejemplo proteínas nucleares de tejido de pescado es preciso romper las células para extraer las proteínas que nos interesan. La ruptura debe sercuidadosa, no tiene que ser excesiva, para evitar la extracción de moléculas contaminantes u otras proteínas que nos son el objeto de estudio (por ejemplo proteínas citoplasmáticas) (1). En el caso particular de este práctico la ruptura de las membranas celulares del tejido de pescado es relativamente directa utilizando solución de lisis (Laemmli sample buffer) y centrifugando la muestra (2). En elcaso que los tejidos sean más duros en necesario la utilización además de fuerzas mecánicas como homogeneizadores y trituradores de tejidos (que permiten disgregar los tejidos y romper las células) (3). Las bacterias por ejemplo son más resistentes a la ruptura ya que poseen pared celular, también los hongos filamentosos y las levaduras son los más resistentes al poseer estructuras celulares quecontienen hasta 80 - 90 % de polisacárido (quitina y glicanos en hongos, manano y glucano en levaduras), además de lípidos y proteínas (3). Para desarrollo correcto de la purificación de proteínas el tejido de pescado debe disgregarse en un 90%. (2)
Luego de que se obtiene la muestra purificada de proteínas se puede realizar la electroforesis con el objetivo de separar las proteínas, el métodoque más se aplica para proteínas es el que emplea geles de poliacrilamida (PAGE = polyacrylamide gel electrophoresis) en presencia del detergente aniónico dodecilsulfato sódico (SDS). Esta técnica se conoce como SDS-PAGE. (Los detalles del procedimiento serán mencionados más adelante). En la preparación del gel, la polimerización de los monómeros de acrilamida produce cadenas lineales, alincluir bisacrilamida, ésta da lugar a puntos de ramificación en el polímero, lo que permite formar una matriz tridimensional, dando lugar al gel de poliacrilamida. El tamaño de los huecos o poros depende de la concentración de acrilamida y del grado de entrecruzamiento (es decir, de la proporción de bisacrilamida con respecto al total). Así, variando la concentración de acrilamida y bisacrilamida enla preparación del gel se consiguen distintos grados de porosidad y, por tanto, distintos intervalos de separación de proteínas. Las muestras proteicas se tratan con SDS para que las proteínas se mantengan desnaturalizadas (4). El SDS tiene la propiedad de unirse a las cadenas polipeptídicas en una proporción masa/masa constante (1.4 g SDS/g de proteína), de modo que en el complejo SDS-proteína lacarga de la proteína queda enmascarada por la de las múltiples moléculas de SDS y ésta es proporcional al tamaño (nº de aminoácidos). Esta electroforesis es discontinua pues utiliza dos geles: un gel concentrador y un gel separador. El primero permite la acumulación de todas las proteínas que se han cargado en los pocillos (lo que beneficia su posterior separación) y el segundo permite laseparación de las proteínas que vienen corriendo en el frente de migración. En la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, la separación de proteínas se hace en función de la masa molecular, ya que todas las proteínas que formaron complejos con el SDS quedaron cargadas negativamente. Una vez realizada la electroforesis el gel debe ser teñido con un colorante específico (generalmente Azul deCoomassie), que permite visualizar las bandas que contienen las proteínas separadas según su tamaño, las de menor peso molecular quedaran en la parte de abajo del gel, y las de mayor peso molecular quedarán arriba. Para que la detección de las proteínas de interés sea más sensible y más específica se puede utilizar la técnica de western blotting. (2)




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