Purificación lisozima de huevo

Práctica 3
Purificación de una enzima: La lisozima de huevo

Introducción
El nombre de lisozima o muramidasa (EC 3.2.1.17) incluye a un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces glicosídicos β(1→4) de los polisacáridos de pared celular bacteriana. Son proteínas globulares constituidas por una sola cadena polipeptídica (129 aminoácidos para la lisozima de Gallus gallus) y depeso molecular comprendido en el rango de 14 a 30 kDa. Estas proteínas contienen cuatro puentes cruzados disulfuro que contribuyen a su elevada estabilidad. La lisozima fue la primera proteína secuenciada, la primera enzima de la que se dispuso un modelo tridimensional (usando cristalografía de rayos X) y la primera para la que se propuso un mecanismo de acción detallado
Objetivo generalPurificar la enzima lisozima a partir de la clara de huevo mediante cromatografía de intercambio catiónico utilizando carboximetilcelulosa.
Objetivo específicos
Apartado a cumplimentar por el alumno

A. Purificación de la lisozima

La cromatografía de intercambio iónico se fundamenta en las propiedades ácido-base de las proteínas. Una proteína, a pH menor de su pI (punto isoeléctrico), tendrácarga positiva y a pH mayor de su pI presentará carga negativa. Por lo que, en el primer caso se unirá a una resina con carga negativa (carboximetil-celulosa, CM-celulosa) y en el segundo a una resina con carga positiva (dietilaminoetil-celulosa, DEAE-celulosa).
Una vez unida la proteína a las resinas, éstas se pueden eluir de dos formas distintas:
1) Variando el pH del medio hasta alcanzar elpI.
2) Mediante un gradiente iónico añadiendo el contraión correspondiente (Na+ en el caso de intercambio catiónico o Cl- para el intercambio aniónico).

REACTIVOS
• Huevos de gallina para la obtención de la enzima
• Tampón A: glicina/NaOH 100 mM, pH 10
• Tampón B: glicina/NaOH 100 mM, pH 10, conteniendo 0.6 M NaCl
• Carboximetil-celulosa (CM)
Activación de la CM: previamente a suutilización, la resina se lava con HCl 0.5 M (5 minutos), 2 veces con H2O (hasta pH neutro), NaOH 0.5 M (5 minutos ) y finalmente dos veces con H2O (hasta pH neutro) Por último se hace una suspensión 1/1 (vol/vol) en tampón glicina/NaOH 100 mM pH 10

DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. Recoger la clara procedente de un huevo y filtrarla a través de una gasa. Diluirla 1/5 (vol/vol) con tampón A.
2.Tomar 10 ml de la muestra de clara diluida en un tubo de centrífuga (F0=10ml) y el resto de solución guardar y rotular como Fracción 0, F0.
3. Añadir al tubo de centrífuga 4 ml de CM-celulosa previamente activada y agitar suavemente durante 15 min, para que la lisozima se adsorba a la resina.
4. Al finalizar la incubación, centrifugar la muestra a 1000 rpm durante 3 min. Guardar el sobrenadante(Fracción 1, F1). Medir el volumen con una probeta. F1=13ml
5. Añadir a la resina (precipitado) 10 ml de tampón A. Agitar suavemente y centrifugar de nuevo. Recoger el sobrenadante (Fracción 2, F2). Medir el volumen de esta fracción con una probeta. F2=10ml
6. Repetir el lavado anterior y desechar el sobrenadante. (Saltamos este paso)
7. Elución. Resuspender la CM-celulosa con 3 ml de tampón B eincubar, agitando suavemente, durante 10 minutos. Centrifugar y recoger el eluido (Fracción 3, F3, lisozima purificada). F3=4ml. (No estará suficientemente purificada, ya que han caído partes de sólido).

B. Medida de la actividad enzimática

La medida de la actividad lisozima se realiza utilizando una suspensión de agregados de pared celular del microorganismo Micrococcus lysodeikticus, enconcentración suficientemente elevada para atenuar, por dispersión, la transmisión de luz monocromática a través de la cubeta de un espectrofotómetro. Al incubar esta suspensión con lisozima, los fragmentos de pared celular se hidrolizan, originado otros más pequeños, lo que reduce la dispersión de luz, que se manifiesta en una reducción en la absorbancia a una longitud de onda fija de 450 nm....