Purificaci n del factor IX recombinante expresado en leche de cerdas transg nicas

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Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2006;22(2)

Instituto “Finlay”, La Habana

Purificación del factor IX recombinante expresado en leche
de cerdas transgénicas
Lic. Armando Cádiz Lahens,1 Lic. Aniel Moya Torres,1 Dr. William Velander,2 Dr.
Manuel Limonta Vidal,3 Lic. Lázaro Joo Sánchez,1 Lic. Alexandro Rodríguez
Rojas,1 Lic. Laritza Solarana Tito,1 Lic. Alina DíazConcepción,3 Lic. Patricia
Caunedo Almagro,3 Dra. Dunia Castillo González3 y Dra. Delfina Almagro
Vázquez3
Resumen
Se purificó a partir de la leche de cerdas transgénicas, factor IX recombinante, y se
obtuvieron rendimientos entre 1 a 2 g de esta proteína por litro, lo que resulta una
nueva vía para la obtención de este producto con una alta eficiencia, ya que su
expresión es 1 000 veces superior a ladel factor IX plasmático humano. Mediante la
combinación de 2 pasos cromatográficos: intercambio iónico en DEAE-Shephadex A50 y cromatografía de afinidad con heparina, se realizó la purificación del factor IX,
con esta leche como material de partida. Se estudiaron diferentes métodos para la
eliminación de las caseínas, contaminante principal del proceso, y se escogió
finalmente laultracentrifugación, por las numerosas ventajas que presenta con
respecto a la precipitación isoeléctrica y la precipitación por sales. El factor IX puede
ser purificado de la leche transgénica con una alta pureza utilizando métodos
cromatográficos que no usan inmunoafinidad y son finalmente escalables en la
producción industrial, lo cual proporciona nuevas perspectivas para el tratamiento de
la hemofilia Bmediante la preparación de posibles formulaciones orales.
Palabras clave: factor IX, purificación, hemofilia B.
La hemofilia B, enfermedad hereditaria de la coagulación sanguínea, afecta a 1 de
cada 25 000 hombres y está causada por una deficiencia en la síntesis de factor IX,
proteína esencial para una eficiente coagulación de la sangre.1
Durante los últimos 50 años, los hemofílicos B han sido tratadoscon plasma fresco y
concentrados de factor IX purificados a partir de plasma, 2 con el riesgo de
infecciones como el virus del VIH y los virus de las hepatitis B y C. En la década de
los 90, fueron introducidos en la terapia de remplazo, preparados de
factor IX recombinante altamente purificados, que mostraron buenos perfiles

terapéuticos. Sin embargo, la tecnología del DNA recombinante es máscostosa,
añadido a deficiencias en algunas modificaciones como la remoción del propéptido, la
gamma carboxilación, la Ser-fosforilación, y la glicosidación.3
La leche constituye un buen medio para la producción de proteínas recombinantes,
pues se han acumulado suficientes conocimientos sobre la fisiología de las células
mamarias en la producción de proteínas heterólogas, 4 y en el caso del factorIX de la
coagulación, según la tecnología desarrollada por Velander y colaboradores. Los
grandes niveles que se producen de estas proteínas en leche, representan una
alternativa muy interesante para el tratamiento terapéutico y profiláctico de los
pacientes hemofílicos.
Recientemente se logró mediante transgénesis, expresar en células mamarias de
cerdas varias proteínas de la coagulación, entreellas el factor IX, con un nivel de
expresión en leche 1 000 veces superior (1 000-2 000 µg/mL) a como se encuentra en
el plasma de individuos sanos.3 Este producto representa una alternativa muy
novedosa y de un alto impacto mundial para el tratamiento de esta enfermedad. Contar
con métodos de purificación escalables como el que desarrollamos en este trabajo,
brindará una posibilidad importante parala obtención de factor IX, de elevada pureza
y con una alta eficacia terapéutica.
Métodos
Obtención de la leche transgénica

Las cerdas transgénicas fueron inyectadas por vía intramuscular con 30-60 UI de
oxitocina para estimular la salida de la leche. La leche fue transferida a botellas
plásticas y transportada de la granja hacia el laboratorio para su procesamiento. En el
laboratorio se...