Purificacion de proteinas

Métodos para el estudio de las proteínas

1. Ensayo y concentración de proteína 2. Fuente y fraccionamiento celular

3. Precipitación salina 4. Cromatografías - filtración - intercambio iónico -afinidad - líquida de alta resolución (HPLC) 5. Electroforesis, isoelectroenfoque y electroforesis bidimensional

actividad específica homogenado centrifugación - diferencial - gradiente diálisisEstructura y función de la proteína

Trituración/Homogeneización

Potter-Elvehjem

Homogenizador de cuchillas

Homogenizador ultrasónico

Centrifugación diferencial

Homogenización deltejido Centrifugación a baja velocidad (1.000 g, 10 min)

Homogenado tisular Homogenización tisular

Sobrenadante centrifugado a velocidad media (20.000 g, 20 min)

Homogenado tisularSobrenadante centrifugado a velocidad elevada (80.000 g, 60 min)

Precipitado conteniendo: células completas, núcleos, citoesqueleto, membrana plasmática Precipitado conteniendo: mitocondrias, lisosomas,peroxisomas Precipitado conteniendo: microsomas (fragmentos de RE), pequeñas vesículas

Sobrenadante centrifugado a velocidad muy elevada (150.000 g, 3 h)

Sobrenadante conteniendo proteínassolubles

Precipitado conteniendo: ribosomas, grandes macromoléculas

Centrifugación en gradiente o zonal
Coeficiente de sedimentación (s) s=
m (1 - v) f

Theodor Svedberg

m = masa de lapartícula/molécula (1- v) = factor de flotación  = densidad de la disolución v = volumen específico de la partícula/molécula f = coeficiente de fricción de la partícula/molécula

Muestra Gradientesacarosa Componentes menos densos

Componentes más densos

Fraccionamiento

Precipitación salina (salting out)

Log solubilidad (g ml-1)

0.5 0 Ab

Mb

-0.5
-1 Fb Hb

1

2 (NH4)2SO4 M]3

Diálisis

Bolsa diálisis Solución concentrada
Tampón

Inicio diálisis

Equilibrio

Métodos cromatográficos

Reservorio

Muestra

Solución (fase móvil) Matriz sólida (fase...