Purificacion enzima ldh
Páginas: 14 (3388 palabras)
Publicado: 25 de noviembre de 2009
[pic]
“Purificación y extracción de L-lactato deshidrogenasa desde músculo esquelético de conejo”
Capponi Alvaro, Fuentes H. Claudio A., Monsalve A. Ivonne E.
Escuela de Ingeniería Civil en Biotecnología, Facultad de Ingeniería y Tecnología, Universidad San Sebastián, Cruz 1577, Concepción, Chile
RESUMEN
El proceso de extracción y purificación de L-lactato deshidrogenasa desdemúsculo esquelético de conejo se realizó en cinco etapas consistentes de: Obtención del extracto, homogenización, fraccionamiento, cromatografía y electroforesis. La obtención de extracto se realizó directamente desde el conejo obteniéndose 98,798g de músculo. La homogenización se realizó en un en un homogenizador de teflón (Turrax) manteniendo en frío. El fraccionamiento comprendiócentrifugaciones diferenciales y precipitaciones en distintos rangos de saturación (20%,40%,60% y 80%).La cromatografía realizada para separar proteínas fue de exclusión molecular y la electroforesis fue de proteínas con Sephadex G-25. Paralelamente se realizó la determinación de parámetros óptimos tanto de la enzima comercial como de la enzima purificada obteniéndose un [pic] y [pic], para la primera y [pic] y[pic] , para la segunda. La temperatura óptima fue de 37ºC y el pH óptimo de 7,3 .Se realizaron mediciones de actividad enzimática durante el procedimiento de purificación obteniéndose para la enzima comercial un valor de 332,80 unidades/ml enzima y para la enzima purificada un valor de 264.177 unidades/ml enzima. Se utilizó como referencia la medición de la actividad enzimática para calcularel porcentaje de purificación total de la enzima y este fue igual al 79.38%. La cuantificación total de proteínas fue de 375,707mg/ml.
Palabras claves: L-lactato deshidrogenasa, purificación, homogenización, fraccionamiento, cromatografía, electroforesis, precipitación, centrifugación
INTRODUCCION
La enzima lactato deshidrogenasa (LDH), es un tetrámero perteneciente a la claseÓxido-reductasa (EC 1.1.1.27) que cataliza la transformación anaerobia de piruvato a lactato según
la siguiente reacción: Piruvato + NADH + H+ ↔ Lactato + NAD+ + H2O. Esta se encuentra ampliamente en tejidos vegetales, animales y microorganismos. Se sintetiza desde dos genes individuales distintos, que originan polipéptidos estructuralmente diferentes pero con la misma actividad catalítica. La LDH poseedos tipos diferentes de subunidades: M y H las cuales dan lugar a 5 tipos de isoenzimas diferentes (H4, M1H3, M2H2, M3H y M4) las cuales se han enumerado del 1 al 5 en función de su movilidad electroforética (la H4 es la que más avanza hacia el ánodo, mientras que la M5 es la de menor movilidad electroforética). Su peso molecular es aproximadamente de 140.000 DA y su estructura está dispuestatetraédricamente, en la que las subunidades están unidas por enlaces hidrófobos, puentes de hidrógeno y fuerzas electrostáticas. Su función es la de reducir reversiblemente el piruvato a lactato. Su centro activo se encuentra en el interior de cada subunidad, siendo específico para el lactato y utiliza únicamente NAD+ como coenzima. La actividad de la enzima se mide a través del consumo de NADH, elcual tiene un máximo de absorción a 340nm, junto con piruvato en exceso, para que el equilibrio se desplace hacia los productos y solo dependa de la concentración de NADH. La LDH es caracterizada a partir de una enzima comercial para la obtención de sus parámetros cinéticos, temperatura y pH óptimo. El objetivo de este trabajo es la obtención y purificación de L -Lactato Deshidrogenasa desdemúsculo de conejo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención del músculo
El tejido utilizado fue extraído de forma directa desde las extremidades de un conejo sano, se dio muerte a este mediante el método de sustancias volátiles, según Del Río (2000). La sustancia utilizada fue éter dietílico. El tejido fue inmediatamente lavado con buffer de extracción consistente de Tris–HCL 50 mM, EDTA 1.5 mM y...
“Purificación y extracción de L-lactato deshidrogenasa desde músculo esquelético de conejo”
Capponi Alvaro, Fuentes H. Claudio A., Monsalve A. Ivonne E.
Escuela de Ingeniería Civil en Biotecnología, Facultad de Ingeniería y Tecnología, Universidad San Sebastián, Cruz 1577, Concepción, Chile
RESUMEN
El proceso de extracción y purificación de L-lactato deshidrogenasa desdemúsculo esquelético de conejo se realizó en cinco etapas consistentes de: Obtención del extracto, homogenización, fraccionamiento, cromatografía y electroforesis. La obtención de extracto se realizó directamente desde el conejo obteniéndose 98,798g de músculo. La homogenización se realizó en un en un homogenizador de teflón (Turrax) manteniendo en frío. El fraccionamiento comprendiócentrifugaciones diferenciales y precipitaciones en distintos rangos de saturación (20%,40%,60% y 80%).La cromatografía realizada para separar proteínas fue de exclusión molecular y la electroforesis fue de proteínas con Sephadex G-25. Paralelamente se realizó la determinación de parámetros óptimos tanto de la enzima comercial como de la enzima purificada obteniéndose un [pic] y [pic], para la primera y [pic] y[pic] , para la segunda. La temperatura óptima fue de 37ºC y el pH óptimo de 7,3 .Se realizaron mediciones de actividad enzimática durante el procedimiento de purificación obteniéndose para la enzima comercial un valor de 332,80 unidades/ml enzima y para la enzima purificada un valor de 264.177 unidades/ml enzima. Se utilizó como referencia la medición de la actividad enzimática para calcularel porcentaje de purificación total de la enzima y este fue igual al 79.38%. La cuantificación total de proteínas fue de 375,707mg/ml.
Palabras claves: L-lactato deshidrogenasa, purificación, homogenización, fraccionamiento, cromatografía, electroforesis, precipitación, centrifugación
INTRODUCCION
La enzima lactato deshidrogenasa (LDH), es un tetrámero perteneciente a la claseÓxido-reductasa (EC 1.1.1.27) que cataliza la transformación anaerobia de piruvato a lactato según
la siguiente reacción: Piruvato + NADH + H+ ↔ Lactato + NAD+ + H2O. Esta se encuentra ampliamente en tejidos vegetales, animales y microorganismos. Se sintetiza desde dos genes individuales distintos, que originan polipéptidos estructuralmente diferentes pero con la misma actividad catalítica. La LDH poseedos tipos diferentes de subunidades: M y H las cuales dan lugar a 5 tipos de isoenzimas diferentes (H4, M1H3, M2H2, M3H y M4) las cuales se han enumerado del 1 al 5 en función de su movilidad electroforética (la H4 es la que más avanza hacia el ánodo, mientras que la M5 es la de menor movilidad electroforética). Su peso molecular es aproximadamente de 140.000 DA y su estructura está dispuestatetraédricamente, en la que las subunidades están unidas por enlaces hidrófobos, puentes de hidrógeno y fuerzas electrostáticas. Su función es la de reducir reversiblemente el piruvato a lactato. Su centro activo se encuentra en el interior de cada subunidad, siendo específico para el lactato y utiliza únicamente NAD+ como coenzima. La actividad de la enzima se mide a través del consumo de NADH, elcual tiene un máximo de absorción a 340nm, junto con piruvato en exceso, para que el equilibrio se desplace hacia los productos y solo dependa de la concentración de NADH. La LDH es caracterizada a partir de una enzima comercial para la obtención de sus parámetros cinéticos, temperatura y pH óptimo. El objetivo de este trabajo es la obtención y purificación de L -Lactato Deshidrogenasa desdemúsculo de conejo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención del músculo
El tejido utilizado fue extraído de forma directa desde las extremidades de un conejo sano, se dio muerte a este mediante el método de sustancias volátiles, según Del Río (2000). La sustancia utilizada fue éter dietílico. El tejido fue inmediatamente lavado con buffer de extracción consistente de Tris–HCL 50 mM, EDTA 1.5 mM y...
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