purificación de GFP”

INFORME DE LABORATORIO N°3:
“purificación de GFP”















- 2010-


Introducción:

la bacteria E.coli se expresa en presencia de Arabinosa la proteína que a la luz UV es de color verde flurecente(GFP); esta proteína se encuentra al interior de la bacteria anteriormente mencionada junto con el contenido intracelular (1), para obtenerla se necesita de varias etapas:
La primera etapa es la de Crecimiento o amplificación celular: Se inocula las colonias delcultivo LB/Amp/Ara/Pglo en este se expresa las bacterias GFP. Este cultivo se realiza en un medio líquido LB/Amp/Ara con agitación vigorosa y un tiempo limitado de 1 día tenemos un intercambio gaseoso eficiente. Luego la Concentración celular: Una vez obtenido un buen número de células se realza una centrifugación a baja velocidad para concentrar dichas celulas. Después se realiza el Rompimientocelular o lisis celular: Hay varias alternativas , una de ellas es utilizando una enzima denominada lisosima o enzima de lisis bacteriana que rompe las cadenas de polisacáridos de la pared celular liberando asi el contenido intracelular. Otro mecanismo es por stress mecánico el cual se utilizan trituradores especiales llamados homogenizadores ( son de acción similar a la de los morteros). Tambiénesta el ultrasonido en la cual se utilizan equipos sonicadores. Además se utiliza criofractura o un congelamiento rápido a los 0º C. Todas estas técnicas las podemos utilizar en conjunto o por separadas con una solución tampón adecuada que mantenga las condiciones nativas de las células, para luego eliminar los restos celulares o células no lisadas se realiza centrifugado a alta velocidad por 15min. Para terminar utilizamos la Separación o purificación de la proteína: GFP posee residuos aminoacidicos de naturaleza hidrofobicos que exponen sus residuos hidrofilicos a de que es una proteína hidrofobica.(2)
Con estas características de tipo molecular utilizaremos para separar GFP del contenido intracelular. Se realiza con la técnica de cromatografía de interaccion hidrofobica (HIC)consiste en colocar en un tubo o columna unas esferas hidrofobicas que pasaran el producto de la lisis los cuales seran ayudado por diferentes tampones salinos estos mismos hacen perder moléculas de agua a la proteína con lo cual cambian su estructura exponiendo su aminoaciditos hidrofobicos hacia el exterior lo que permite interactuar con las moléculas de la columna o tubo , en el caso de GFP quedaretenida por su carácter hidrofobico.
La transferencia de proteína o blotting es la inmovilización de proteínas sobre las membranas sintéticas, luego la detección empleando métodos como western blot para luego teñir las proteínas retenidas en la membrana.(3)

Objetivos:

Separar las proteínas GFP del cultivo bacteriano a través de los métodos anteriormente mencionados.
Ver los resultados deproteínas mediante el método “dot blot” utilizando la tinción Rojo Ponceau.
Lograr ver las proteínas decantadas en solución por medio de luz UV.
Obtener exitosamente la proteína GFP purificada.


Materiales y métodos:


Previamente obtenido el cultivo bacteriano LB/AMP/ARA y sumergido las colonias en tubos de ensayo se proceden a iniciar el práctico. Con la pipeta estéril setransfieren 2 ml del tubo de cultivo bacteriano de Echerichia coli en medio LB/Amp/Ara/Pglo+ al microtubo donde se expresa la GFP, luego se centrifugan por 5 minutos a 14.000 rpm. Después se descarta el sobrenadante quedándonos con el precipitado, para luego agregar 2ml del caldo bacteriano repitiendo el procedimiento anterior. Después en el microtubo se agrega 250ul del buffer TE y 1 gota de lisozima...