Purificación de IpG

Purificación de IgG a partir de suero humano
La purificación de proteínas se logra en general a partir de la aplicación de sucesivos procedimientos separativos, con diferentes, y en general crecientes, capacidades resolutivas.
La inmunoglobulina G (IgG) es una proteína que se encuentra en relativa abundancia en el suero humano y de mamíferos en general. En el suero humano se encuentran muchasproteínas: la más abundante es la albúmina y en segundo término se encuentran las inmunoglobulinas, de las cuales la de mayor concentración normal es la IgG y las restantes son denominadas M, A, D, y E. Estas inmunoglobulinas, como su nombre lo indica, poseen funciones dentro de los mecanismos de defensa inmunológica, y además poseen características estructurales comunes. Si las proteínas del suerose separan por electroforesis en acetato de celulosa se pueden observar en general cinco grandes fracciones denominadas: ALBÚMINA, ALFA 1, ALFA 2, BETA Y GAMMA GLOBULINAS, cuyo desplazamiento es en ese orden hacia el polo positivo, es decir, la que mas se desplaza es la albúmina y luego en orden decreciente. La fracción que menos migra (las denominadas GAMMA globulinas), está constituidamayoritariamente por las inmunoglobulinas.
Como característica estructural común, cada inmunoglobulina está formada por dos cadenas de menor peso molecular, que se denominan cadenas livianas, y dos cadenas de mayor peso molecular, que se denominan pesadas. Las cadenas se encuentran unidas por puentes disulfuro, como lo indica la Figura 1.

Figura 1. Esquema de la estructura de la inmunoglobulina G.Como la proteína a purificar se encuentra soluble, no es necesario aplicar procesos de disrupción o solubilización, y directamente se comienza con la separación.
La estrategia de separación consiste en las siguientes etapas:

Etapa 1: Purificación parcial por fraccionamiento salino con sulfato de amonio. Se procura obtener una fracción que se encuentre enriquecida en las inmunoglobulinas,separándolas del componente mayoritario, que es la albúmina, y de otros contaminantes minoritarios.
Etapa 2: Acondicionamiento de la fracción obtenida en el fraccionamiento salino por cromatografía de filtración por geles. Esta no es en sí una etapa de purificación, sino de equilibrado de la muestra para su posterior purificación por cromatografía de intercambio iónico. Se efectúa por cromatografíade tamiz molecular. El objetivo de este pasaje por la columna es eliminar las sales, el amonio y el sulfato que acompañan a las inmunoglobulinas, dejando la muestra equilibrada en las condiciones de siembra en la columna de intercambio iónico.
Etapa 3: Purificación de la IgG por separación cromatográfica en resina de intercambio iónico. Se procura separar la IgG de las restantes inmunoglobulinasy otros contaminantes menores.
Etapa 4: Comprobación del grado de pureza alcanzado mediante la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en diferentes condiciones.

PRIMERA ETAPA: Precipitación salina.

La solubilidad de una proteína depende de la I, D, pH, T y la naturaleza de la sal, y es distinta para cada proteína en particular.
Analizaremos cada uno de estos factores:A. Constante dieléctrica: La solubilidad de los aminoácidos polares y gran parte de las proteínas es mayor en medios de elevada constante dieléctrica, como por ejemplo el agua. La adición de solventes relativamente polares como el alcohol metílico, etílico o acetona, ejercen un efecto deshidratante y disminuyen, por lo tanto, la solubilidad. Los fraccionamientos salinos con sales neutras se llevana cabo en medios acuosos, por lo que el factor disolvente es siempre constante.
B. Temperatura: La solubilidad de las proteínas diminuye generalmente con la temperatura, por lo tanto cuando se realiza el fraccionamiento salino, se coloca en baño de hielo para favorecer la precipitación. Por otro lado, esto colabora en mantener la estabilidad conformacional
C. pH: En esta experiencia no...