Purificación Lisozima

AISLAMIENTO, PURIFICACIÓN Y ESTUDIO DE LA
LISOZIMA DE CLARA DE HUEVO DE GALLINA
; equipo nº 13
Resumen
El conocimiento de la estructura y características de una proteína es fundamental para trabajar con
ella y obtener productos de su manejo. Gracias a técnicas de aislamiento, purificación y
determinación de masa molecular y actividad enzimática conseguimos conocer características ycomportamiento de enzimas. Manejar estas técnicas es imprescindible para el trabajo en
laboratorio. En la práctica trataremos de aislar y purificar la lisozima de la clara de un huevo de
gallina.
1. INTRODUCCIÓN
Se consideran 'lisozimas' las enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces beta (1-4) de polímeros
de N-acetilglucosamina (NAG) y N-acetilmurámico (NAM), componentes fundamentales delpeptidoglicano de la pared celular bacteriana
(Fig. 0).
La enzima se encuentra en secreciones
humanas, de otros vertebrados e
invertebrados, plantas, bacterias e incluso
virus; se consideran parte de la inmunidad
innata.
Todas son proteínas globulares de una única
cadena, pero pueden diferir en su estructura
primaria. Todas son proteínas básicas (pI=10.5-11) [1], estables a pH ácido, de bajamasa molecular
(14-30 kDa) y presentan actividad frente a Micrococcus luteus.
La lisozima de clara de huevo está formada por una cadena polipeptídica de 129 aminoácidos
(14,6kd) con cuatro enlaces disulfuro. La molécula tiene forma más o menos helicoidal, compuesta
por varias hélices alfa y una lámina beta extendida formada por tres hojas beta. No es la proteína
mayoritaria del huevo, que esla ovoalbúmina, pero también está en una alta proporción.
Alexander Fleming en 1922 fue el primero en descubrir la estructura de la enzima y más tarde David
Chilton Phillips propuso un modelo tridimensional detallado [2], obtenido por cristalografía de rayos
X, y determinó el mecanismo catalítico que usa para la hidrólisis. Fue la primera enzima de la que
se supo tantos detalles ycaracterísticas.
Objetivo:
Aislar y purificar una enzima, determinar su masa molecular y actividad enzimática y comprobar el
grado de purificación. Analizar los resultados para proponer una mejora en el método y los
procedimientos.
2. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
Material biológico: huevo de gallina
Material de laboratorio:
·(Preparación de la muestra) Ácido acético 0.1M; probeta, embudo, gasa doble,vaso precipitado;
centrífuga; baño termostatizado.
·(Aislamiento y purificación) Cromatografía de intercambio iónico: columna cromatográfica, pinza
Hoffman, lana de vidrio; Amberlita CG-50, tampón fosfato potásico: 0.1 M pH 6.6, 1 M pH 7.0, 0.6 M
pH 6.6
·(Determinación de actividad y cantidad de proteína) Paredes Micrococcus luteus en tampón fosfato
0.6 M pH 6.6, reactivo Bradford, BSA(1mg/ml)
· (Electroforesis) Gel poliacrilamida 15%,cubeta, fuente de alimentación, tampón de carga, tampón
de electroforesis, patrones, soluciones de teñido y desteñido.

Método:
Aislamiento
La clara de huevo es sometida a varios tratamientos antes de la cromatografía; a modo comparativo
se realizarán dos tipos de cromatografía. En el caso de este equipo se lleva a cabo una
cromatografía deintercambio iónico. Tras cada tratamiento ha de medirse el volumen de muestra
recuperado.
Las fracciones de E1 se incuban en tubos de ensayo en un baño termostatizado.
Para la cromatografía de intercambio iónico se añade a E2 3.2 ml de tampón fosfato 0.1M y 41
gotas de tampón fosfato 1M, llevando su pH hasta 6.41. En tubos de ensayo, se recogen fracciones
de 10 ml durante el lavado y de 3 mldurante la elución. Más tarde se representará el perfil de
elución y se determinará la actividad de las fracciones con mayor absorbancia, para elegir las
fracciones que conformarán E3.

Determinación actividad enzimática.
En un espectrofotómetro mediremos de forma continuada la absorbancia de la suspensión de
paredes en presencia de la muestra. Anotaremos, durante 3min, la medida de...